پایان نامه جداسازی و شناسائی اندوفیتهای گیاهان داروئی بابونه نعناع فلفلی

دانشگاه آزاد اسلامی

واحد دامغان

دانشکده علوم پایه

پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد «M.Sc»

رشته: زیست شناسی

گرایش: میکروب شناسی

عنوان:

جداسازی و شناسائی اندوفیتهای گیاهان داروئی بابونه نعناع فلفلی مارچوبه بومی استان گلستان و تاثیر آنها در گیاهان

استاد راهنما:

دکتر محمد حسین ارزانش

استاد مشاور:

دکتر رضا نظام زاده

تکه هایی از متن به عنوان نمونه :

عنوان	صفحه
چکیده	۱
مقدمه	۲
اهمیت و ضرورت تحقیق	۳
اهداف تحقیق	۳
فصل اول- کلیات
۱-۱-اندوفیت	۴
۱-۱-۱- مقدمه	۴
۱-۱-۲- اکولوژی باکتری های اندوفیت	۵
۱-۲-۳- منشاء باکتری های اندوفیت	۵
۱-۱-۴- نحوه ی ورود باکتری های اندوفیت به درون بافت های گیاهی.	۸
۱-۱-۵- حرکت باکتری های اندوفیت در بافت های گیاهی.	۱۰
۱-۱-۶ – محل استقرار باکتری های اندوفیت	۱۱
۱-۱-۷ – تراکم جمعیت باکتری های اندوفیت	۱۲
۱-۱-۷-۱- فاکتورهای زنده	۱۳
۱-۱-۷-۱-۱- میکروارگانیسم های همراه با گیاه	۱۳
۱-۱-۷-۱-۱-۱- باکتری ها و قارچ ها	۱۳
۱-۱-۷-۱-۱-۲- ویروس ها.	۱۳
۱-۱-۷-۱-۱-۳- نماتد ها.	۱۳
۱-۱-۷-۱-۲- ژنوتیپ گیاه.	۱۴
۱-۱-۷-۲- فاکتورهای غیر زنده	۱۴
۱-۱-۸- اثرات مفید باکتری های اندوفیت گیاهی.	۱۵
۱-۱-۸-۱- افزایش رشد گیاه	۱۵
۱-۱-۸-۲- کنترل بیولوژیکی بیمارگرهای گیاهی	۱۷
۱-۱-۸-۳- استفاده ازاندوفیت ها در مهندسی ژنتیک	۱۷
۱-۱-۸-۴- افزایش تولید مواد دارویی توسط گیاه	۱۷
۱-۱-۹- نحوه ی استفاده از باکتری های اندوفیت	۱۸
۱-۲- نعناع فلفلی	۱۸
۱-۲-۱- ترکیبات.	۱۹
۱-۲-۲- خاستگاه و پراکنش	۱۹
۱-۲-۳- استفاده های دارویی	۱۹
۱-۳- مارچوبه.	۱۹
۱-۳-۱- خاستگاه و پراکنش	۲۰
۱-۳-۲- استفاده های دارویی	۲۰
۱-۴- بابونه.	۲۰
۱-۴-۱- ترکیبات شیمیایی	۲۰
۱-۴-۲- خواص دارویی و درمانی	۲۰
۱-۵- باسیلوس	۲۱
۱-۵-۱- مقدمه	۲۱
۱-۵-۲- باسیلوس های خاک و ویژگی آنها	۲۴
۱-۵-۳- رنگ آمیزی گرم برای تشخیص باسیلوس ها	۲۴
۱-۶- قارچ ها	۲۴
۱-۶-۱- معرفی کلی ماهیت قارچ ها	۲۴
۱-۶-۲- اهمیت بالینی قارچ ها.	۲۵
۱-۶-۳- بیماری زایی قارچ ها.	۲۶
۱-۶-۳-۱- کنترل بیماری های قارچی	۲۶
۱-۶-۴- معرفی قارچ های مورد آزمایش	۲۶
۱-۶-۴-۱- آسپرژیلوس های بیماری زا	۲۶
۱-۶-۴-۲- فوزاریوم.	۲۷
۱-۶-۴-۳- آلترناریا.	۲۷
۱-۶-۴-۴- موکور.	۲۸
فصل دوم : مروری برمطالعات گذشته
فصل سوم : مواد و روش ها
۳-۱- تجهیزات و دستگاه ها	۳۳
۳-۲- انواع و ترکیبات محیط کشت های مورد استفاده.	۳۴
۳-۳- نوع مطالعه و روش نمونه گیری	۳۴
۳-۴- وسایل نمونه یری.	۳۴
۳-۵- وسایل آزمایشگاهی	۳۴
۳-۶- انتخاب محیط کشت غربالگری	۳۴
۳-۷- جداسازی باکتری های اندوفیت از ریشه گیاهان دارویی.	۳۵
۳-۷-۱- خالص سازی کشت های باکتریایی.	۳۵
۳-۸- شناسایی مقدماتی جنس و گونه ی جدایه های باکتریایی	۳۴
۳-۸-۱- بررسی توانایی رشد در غلظت های مختلف Nacl	۳۶
۳-۸-۲- بررسی فعالیت آنزیمی.	۳۶
۳-۸-۲-۱- فعالیت اوره آزی.	۳۶
۳-۸-۳- بررسی فعالیت تجزیه ای.	۳۶
۳-۸-۳-۱- تجزیه نشاسته.	۳۶
۳-۹- شناسایی تکمیلی(شناسایی مولکولی با روش ریبوتایپینگ)	۳۷
۳-۹-۱- شرایط PCR	۳۸
۳-۹-۲- تعیین توالی DNA.	۳۹
۳-۱۰- آزمون بازدارندگی رشد عوامل بیماری زای گیاهی	۳۹
۳-۱۰-۱- تهیه سوسپانسیون باکتری ها.	۳۹
۳-۱۱- اثر تلقیح باکتری های اندوفیت روی پارامتر رویشی گیاه	۴۰
۳-۱۱-۱- مرحله کاشت	۴۰
۳-۱۱-۲- مرحله داشت و تنک کردن.	۴۱
۳-۱۲- اندازه گیری طولی گیاه	۴۱
فصل چهارم : نتایج
۴-۱- جداسازی باکتری های اندوفیت از ریشه گیاهان دارویی.	۴۲
۴-۲- نتایج تست های بیو شیمیایی.	۴۴
۴-۳- تعیین توالی محصولات نهایی PCR.	۴۵
۴-۳-۱- نتایج حاصل از سکوئنسینگ ژن ۱۶ s rDNA باکتری	۴۵
۴-۴- نتایج آنتاگونیسمی بدست آمده از سویه های باسیلوس علیه قارچ های مورد آزمایش	۵۸
۴-۴-۱- نتایج اثر ضد قارچی علیه آسپرژیلوس نایجر	۵۹
۴-۴-۲- نتایج اثر ضد قارچی علیه فوزاریوم اکسیپوروم.	۶۰
۴-۴-۳- نتایج اثر ضد فارچی علیه آلترناریا آلترناتا.	۶۲
۴-۴-۴- نتایج اثر ضد قارچی علیه موکور.	۶۳
۴-۵- نتایج اندازه گیری رشد طولی گیاه.	۶۵
۴-۵-۱- نتایج اندازه گیری رشد طولی در گیاه مارچوبه.	۶۶
۴-۵-۲- نتایج اندازه گیری رشد طولی در گیاه نعناع فلفلی	۶۷
منابع.	۷۲

چکیده

اندوفیت ها میکروارگانیسم هایی اند که حداقل بخشی از زندگی خود را در گیاه به سر می برند. آنها از گیاه سود می برند و از مواد مغذی گیاه استفاده می کند و گیاه نیز به نوبه ی خود با کاهش استرس وافزایش رشد از این تعامل سود می برد. در گذشته تصور می شد که باکتری های اندوفیت باعث بیماری زایی خفیفی در گیاهان می شوند اما تحقیقات اخیر ثابت نمود که این دسته از باکتری ها قادر هستند رشد گیاه را بهبود بخشیده و سبب افزایش مقاومت علیه بیمارگرهای گیاهی شوند. در این مطالعه به جداسازی اندوفیت های سه گیاه داروئی به نام های نعناع فلفلی، بابونه و مارچوبه پرداخته شد که نمونه گیاهان از سه منطقه استان گلستان جمع آوری شد. نتایج حاصل از شناسایی، سویه های جدا شده را در جنس باسیلوس قرار داد. شش باکتری اندوفیت (هر گیاه دو اندوفیت) جداشد. اندوفیت های جدا شده از نظر پتانسیل ضد قارچی علیه چهار قارچ بنام فوزاریوم اکسی پوروم، آسپرژیلوس نایجر، آلترناریا آلترناتا و موکور مورد مطالعه قرار گرفتندکه همگی آنها اثر ضد قارچی نشان دادند. در بین آنها اندوفیت های موجود در نعناع فلفلی بیشترین اثرضد قارچی را روی عوامل بیماری زای گیاهی نشان داد. همین طور اثر آنها در رشد گیاه نیز بررسی شد که آزمایشات نتایج قابل قبولی از اثرمثبت آنها در رشد گیاه را نشان داد.

کلمات کلیدی: گیاهان دارویی، اندوفیت، آنتاگونیسمی، باسیلوس

مقدمه

حضور و استقرار باکتری های غیر بیماری زا در بافت های گیاهی به سال ۱۹۲۶ و به تئوری پروتی[۱] بر می گردد. بعد از سال ۱۹۴۰ تاکنون گزارشات زیادی در ارتباط با باکتری های اندوفیت بومی در بافت های مختلف گیاهی وجود دارد(هالمن و همکاران ۱۹۹۷)[۲].

در گذشته تصور می شد که باکتری های اندوفیت باعث بیماری زایی خفیفی در گیاهان می شوند اما تحقیقات اخیر ثابت نمود که این دسته از باکتری ها قادرهستند رشد گیاه را بهبود بخشیده و سبب افزایش مقاومت علیه بیمارگرهای گیاهی شوند(هالمن و همکاران ۱۹۹۷).

از نظر تکاملی به نظر می رسد که باکتری های اندوفیت حد واسط باکتری های ساپروفیت و باکتری های بیمارگر گیاهی بوده و آنها ساپروفیت هایی اند که توانسته اند خود را در پناهگاهی حفظ نمایند و بدون اینکه میزبان خود را از بین ببرند از مواد موجود در گیاه برای رشد و تکثیر خود استفاده نمایند. فسیل ها ارتباط بین گیاهان و اندوفیت ها را نشان می دهند، در نتیجه اندوفیت ها نقش مهم و دراز مدتی را در تکامل حیات بر روی زمین بر عهده داشتند.

(هالمن و همکاران ۱۹۹۷).

اندوفیت ها درون گیاه حضور دارند و بیش از ۱۲۰ سال است که شناخته شده اند. بعد ها آنها را به عنوان میکروارگانیسم هایی که می توان آنها را از سطح سترون گیاه جدا نمود شناختند و در علم زراعت نیز این مفهوم بیشتر باکتری هایی را در بر می گیرد که می توانند از سطح سترون بافت جدا شوند و به طور آشکار به گیاه میزبان آسیب نمی رسانند.

اغلب این باکتری ها از خاک منشاء می گیرند و باید ابتدا در گیاه کلنیزه شوند که این کلنیزاسیون عمدتا از طریق ترک، زخم، آسیب ریشه صورت می گیرد که به این مناطق اصطلاحا”نقطه داغ[۳] می گویند.

بعد از کلنیزاسیون و ورود باکتری ها به گیاه به سرعت در فضای بین سلولی در ریشه گسترش یافته و سپس سیستم های ژنتیک اختصاصی بین باکتری و گیاه فعال می شود.

اندوفیت ها در گیاه از فرآیندهای سلولی استفاده کرده و از طریق قشر مغز به سایر بافت ها گسترش می یابند که در این فرآیند آنزیم هایی نظیر اندوگلوکانامیس و اندوپلی گالاکتورونیداس را می توان نام برد در این زمان اندوفیت ها می توانند به سرعت در گیاه تکثیر یابند و تعداد خود را افزایش دهند. این باکتری ها قادر به تنظیم سطح اتیلن در گیاه اند و این عمل را ازدو طریق ،شکستن ACC و یا مهار ACC سنتتاز انجام می دهند.

همان طور که جانوران و انسان ها به طور معمول با میکرو ارگانیسم های متنوعی در ارتباط اند و میکروارگانیسم ها در توسعه و تحریک سیستم ایمنی نقش مهمی را ایفا می کنند به طور مشابه باکتری های گیاهی یا اندوفیت ها نیز در تحریک واکنش های دفاعی در گیاه نقش دارند و باعث رشد بهتر گیاه از طریق تثبیت نیتروژن، افزایش مواد معدنی در دسترس، تولید ۲و۳ بوتان دی ال، استوئین که مسئول ارتقاء گیاه اند می شوند.

این باکتری ها با تولید مواد ضد میکروبی مانند ترپونوئید، فلاوونوئید، ایزوفلاوونوئید در گیاه باعث مقاومت گیاه در برابر عامل میکروبی بیماری زا در آن می شوند.

با توجه به موقعیت جغرافیایی استان گلستان باکتری های بیشماری می توان از خاک این منطقه جدا نمود که برخی از آنها به صورت اندوفیت می باشند. با توجه به اینکه در مناطق شمالی بیشتر منطقه قابل کشت می باشد و از طرفی این باکتری ها نقش بسیار مهمی را در رشد گیاه و کنترل عوامل بیماری زا در گیاهان ایفا می کنند کمک بسیار بزرگی می تواند در بخش کشاورزی باشد. البته با توجه به اینکه در ایران کمتر به این مسئله پرداخته شده است پس مطالعه روی این موضوع می تواند بسیار حائز اهمیت باشد.

اهمیت و ضرورت تحقیق

عدم اطلاعات قبلی در زمینه جداسازی و شناسائی باکتری های اندوفیت از گیاهان داروئی در استان
بررسی خاصیت ضد میکروبی جدایه های باکتریایی اندوفیت های جدا شده از گیاهان در برابر پاتوژن های قارچی
بررسی افزایش توان رشدی در گیاهان حاوی اندوفیت ها در مقابل گیاهان فاقد اندوفیت ها و استفاده از آنها به جای کود های شیمیایی

اهداف تحقیق :

اندوفیت های ۳ گیاه داروئی به نام های نعناع فلفلی، مارچوبه و بابونه جداسازی و شناسائی شدند.

۲.اثرات ضد قارچی اندوفیت های جداشده بررسی شدند.

۳.توانائی اندوفیت های جدا شده روی افزایش رشد گیاه بررسی شد.

فصل اول

کلیات

۱-۱- اندوفیت

۱-۱-۱- مقدمه

حضور و استقرار باکتری های غیربیماری زا در بافت های گیاهی به سال ۱۹۲۶ و به تئوری پروتی[۴] برمی گردد.

بعدازسال ۱۹۴۰ تاکنون گزارشات زیادی درارتباط با باکتری های اندوفیت به عنوان عوامل بیماری زایی خفیف درگیاهان وجود دارد، اما تحقیقات اخیرثابت نمودکه این دسته از باکتری قادرهستند رشد گیاه را بهبود بخشیده وسبب افزایش مقاومت علیه بیمارگرهای گیاهی شوند. باکتری های اندوفیت دراکثر گونه های گیاهی حضور دارند.

از نظر تکاملی باکتری های اندوفیت حد واسط باکتری های ساپروفیت و باکتری های بیمارگر گیاهی بوده و در واقع ساپروفیتی اند که به سمت بیمارگری تکامل یافته اند و در واقع اندوفیت ها از بیمارگرهای گیاهی تکامل یافته تر بوده و توانسته اند خود را در پناهگاهی حفظ نمایند، بدون آنکه میزبان خود را از بین ببرنداز مواد موجود در گیاه برای رشد و تکثیر خوداستفاده می نمایند(هالمن و همکاران ۱۹۹۷).

این میکروارگانیسم هادر قرن نوزدهم شناخته شده اند ولی بررسی قابل توجهی روی آنها صورت نگرفت. اندوفیت ها میکروارگانیسم هایی اند که حداقل یک مرحله از چرخه ی زندگی خود را درون گیاهان سپری می کنند. تعاریف مختلفی برای اندوفیت وجود دارد:

کادو[۵] عنوان می کند که اندوفیت های باکتریایی در بافت های زنده گیاهی ساکن اند، بدون آنکه به گیاه صدمه ای بزنند.

کوئیزیل[۶] عنوان می کند که اندوفیت ها قادراند همزیستی داخلی با گیاه برقرار نموده و یک محیط سودمند اکولوژیکی را به واسطه حضور اندونیت ایجاد کنند که گیاه به واسطه ی آن تنش های محیطی را تحمل نموده یا سبب بهبودافزایش رشد گیاه شوند.

ویلسون[۷] عنوان می کند باکتری های اندوفیت بافت های غیر زنده ی گیاه را مورد تهاجم قرار داده ولی علائمی از بیماری را در گیاه ایجاد نمی کند(هالمن و همکاران ۱۹۹۷).

باکتری های اندوفیت باکتری هایی اند با منشا محیط اطراف ریشه (خاک) که حداقل بخشی از چرخه ی زندگی خود را در گیاه به سر می برند و توانسته اند خود را در پناهگاهی حفظ نمایند بدون آنکه به میزبان خود آسیب بزننداز مواد موجود در گیاه برای رشد و تکثیر خود استفاده می کنند و در تعامل باعث افزایش رشد و تحمل تنش های محیطی برای گیاه می شوند.(پابلو و همکاران ۲۰۰۸)[۸].

۱-۱-۲- اکولوژی باکتری های اندوفیت

اندوفیت بودن یک مزیت اکولوژیکی است که بعضی از باکتری ها قادراند بافت های درونی گیاه را کلنیزه نمایند این در حالی است که تعدادی از باکتری ها قادراند گیاه را فقط به صورت اپی فیت کلنیزه نمایند.

محیط داخلی گیاه یک محیط حفاظت شده و یکنواختی را برای میکروارگانیسم ها فراهم می کند. عواملی مثل درجه حرارت، اشعه ماوراء بنفش و رقابت های میکروبی از جمله عواملی اند که بقاء طولانی مدت باکتری ها را محدود می سازند. استقرار و بقاء یک جمعیت باکتریایی درون بافت گیاه تحت تاثیر عوامل قرار می گیردکه سلامتی گیاه را نیزتحت تاثیر قرار می دهند(هالمن و همکاران ۱۹۹۷)[۹].

تعامل بین گیاه واندوفیت مستلزم آن است که هر دو بتوانند موانع فیزیکی و شیمیایی را که بر سر راه دارند با موفقیت پشت سر نهند تا این ارتباط شکل گیرد(پابلو و همکاران ۲۰۰۸).

۱-۱-۳- منشاء باکتری های اندوفیت

بیشترین پرسش هایی که در ارتباط با باکتری های اندوفیتی مطرح است این است که منشا باکتری های اندوفیتی از کجاست و چگونه وارد گیاه می شوند؟(هالمن و همکاران ۱۹۹۷)

شروع با این فرض است که اندوفیت ازخاکی که گیاه میزبان در حال رشداست سرچشمه می گیرد و فاکتورهای خاک کلنیزه شدن باکتری در گیاه را مشخص می کند(پابلو و همکاران ۲۰۰۸).

در واقع باکتری های اپی فیت، فیلوسفر و ریزوسفر به عنوان منبع باکتری های اندوفیت ذکر شوند. تبادل جمعیتی بین جمعیت های باکتریایی خارج و داخل گیاه از طریق روزنه ها صورت می گیرد. بنابراین باکتری هایی وجود دارندکه قادراند به هر دوصورت اپی فیت و اندوفیت گیاه را کلنیزه کنند(هالمن و همکاران ۱۹۹۷)[۱۰].

فاکتورهایی نظیر ژنوتیپ گیاه، مرحله رشد، وضعیت فیزیولوژیکی، نوع بافت گیاهی، شرایط محیطی (منظورخاک) وشیوه های کشاورزی اغلب تعیین کننده ی کلنیزاسیون اندوفیت ها و جامعه اندوسفری می باشند. علاوه براین موارد صفات ذاتی باکتریایی نیز در کلنیزاسیون و تنوع اندوفیتی نقش مهمی را بازی می کند.

به عنوان مثال دیده شده که نسبت باکتری هایی که حرکت سوارمینگ دارند واز داخل ریشه ی گیاه گندم جدا شدند پنج برابر بیشتراز تعداد آنها در ریزوسفر خاک بوده و این نشان می دهد که باکتری هایی که حرکت سوارمینگ داشتند با حرکت خود از طریق کموتاکسی جذب ریشه شده و موفق به تشکیل میکروکلنی شدند(پابلو و همکاران ۲۰۰۸)[۱۱].

در مطالعات میکروسکوپ الکترونی بذر برنج مشاهده شد که جمعیت پایینی از باکتری های اندوفیت در محل های حفاظت شده ای در پوشش بذر، پوسته های بذری، بافت های جنینی حضور دارند، باکتری های اندوفیت این مکان ها را از میان شکاف های ریزی که در پوشش های بذر وجود دارد کلنیزه می کنند.

زمان جوانه زنی بذر، باکتری ریشه را کلنیزه نمود و در استیل ریشه بالاترین تمرکز را دارد. در تیمار بذری باباکتری اندوفیت، رادیکال های ریشه که تازه از پوشش بذری خارج شوند کلنیزه می شوند. کلنیزه شدن بافت توسط اندوفیت ها، مهاجرت باکتری ها از میان شکاف های تشکیل شده، در اثر جوانه زنی بذر شروع شده و وارد اندوسپرم می شود وبدین صورت در