اسفناج گیاهی است یک ساله، دارای ساقه ای راست، به ارتفاع نیم متر که برگ های آن پهن و نرم مثلثی شکل به رنگ سبز می باشند. اسفناج نسبت به سرمای زمستان مقاوم است. دو نوع اسفناج وجود دارد که به نام های پاییزه و بهاره وجود دارند. اسفناج بهاره، در فصل بهار کاشته می شود و به اسفناج انگلیسی معروف است، اما نوع پاییزه آن که به خاک بسیار غنی احتیاج دارد، در پاییز کاشته می شود. گل های اسفناج به رنگ سبز کم رنگ می باشد. اسفناج به دلیل مواد غذایی فراوان، کشت آن امروز در تمام نقاط دنیا معمول می باشد (پیوست، ۱۳۸۸). TAV یکی از ویروس های آلوده کننده گیاه اسفناج بوده که سبب ایجاد علائم بد شکلی، کوتولگی و رنگ پریدگی شدید در برگ ها ی این گیاه می گردد. از دیگر ویروس های آلوده کننده ی گیاه اسفناج می توان به (CMV)Cucumber mosaic virus.، (TuMV)Turnip mosaic virus و Spinach latent virus (SLV) اشاره نمود .(Okonkwo, 1974)
۱-۲-۲-۱۰- خانواده Campanulaceae
۱-۲-۲-۳-۱۰- گل استکانی^[۲۶]
گل استکانی در سال ۱۹۶۵ توسط Noordam به عنوان میزبان طبیعی ویروس TAV گزارش گردید (Hollings & Stone, 1970). این گیاه بومی جنوب اروپا و کشور فرانسه بوده و دارای بیش از ۳۰۰ گونه می باشد. گل استکانی شامل انواع یکساله، دو ساله و چند ساله می باشد و از نادر گیاهانی است که در خاک های آهکی بهتر رشد می کند (قاسمی و کافی، ۱۳۸۴). ویروس TAV در گل استکانی بذرزاد می باشد. از جمله علائم ویروس در این گیاه می توان به شکستگی رنگ گل ها و ایجاد لکه های کلروز و نکروز در برگ ها اشاره نمود (Hollings & Stone, 1970).
۱-۳- اهداف تحقیق
در این تحقیق ویروس بیبذری گوجه فرنگی برای نخستین بار از ایران و از گیاهان اطلسی و داوودی معرفی میگردد. با توجه به دامنه میزبانی گسترده این ویروس و جدید بودن آن در کشور، لذا هدف از این تحقیق شامل موارد زیر میباشد:

۱- شناسایی ویروس بی بذری گوجه فرنگی از طریق آزمونهای سرولوژیکی (الایزا^[۲۷]) و مولکولی (پی.سی.آر^[۲۸])
۲- همسانهسازی و تعیین ترادف طول کامل جدایه ایرانی TAV بدست آمده از گیاه اطلسی
۳- همسانهسازی و تعیین ترادف ژن پروتئین پوششی^[۲۹] جدایه ایرانی TAV بدست آمده از گیاه داوودی
۴-تعیین جایگاه تکاملی جدایههای ایرانی ویروس بی بذری گوجه فرنگی در مقایسه با سایر جدایههای موجود در بانک ژن
۵- مقایسه ترادف نوکلئوتیدی و اسیدهایآمینه جدایه های ایرانی TAV با سایر جدایه های این ویروس موجود در بانک ژن
۶- تعیین دامنه میزبانی جدایههای ایرانی ویروس بی بذری گوجه فرنگی
فصل دوم
بررسی منابع
۲-۱- جایگاه ویروس بی بذری گوجه فرنگی در طبقه بندی ویروسهای گیاهی
ویروس بی بذری گوجه فرنگی عضو جنس کوکوموویروس می باشد. نام جنس از نام ویروس تیپ این گروه یعنی ویروس موزائیک خیار^[۳۰] گرفته شده است که در سال ۱۹۷۱ به عنوان یک گروه ویروسی مستقل نامگذاری و معرفی گردید. ویروس کوتولگی بادام زمینی^[۳۱] گونه دیگر این جنس می باشد. علی رغم اینکه در طبقه بندی ویروس های گیاهی، بالاخانواده ها جایگاه رسمی ندارند، اغلب اشاره می شود که این جنس به خانواده بروموویریده و بالا خانواده Alphavirus-like تعلق دارد که ویروس های حیوانی را نیز شامل می شود (جدول ۲-۱) .(Palukaitis & Garcia-Arenal, 2003) از دیگر اعضای جنس کوکوموویروس میتوان به ویروسهای Cowpea bamding mosaic virus، Cowpea ringspot virus و Bean distortion mosaic virus اشاره نمود (White et al., ۱۹۵۵). بررسی های مولکولی بر روی دو ویروس اول صورت گرفته ولی به نظر می رسد که هیچ گزارش دیگری از زمان آخرین گزارش در مورد این ویروس ها وجود ندارد (Edwardson & Christie, 1991). آخرین ویروس (BDMV) هم از یک نوترکیبی طبیعی بین TAV و CMV به وجود آمده است (Palukaitis & Garcia-Arenal, 2003).
۲-۲- جنس کوکوموویروس
۲-۲-۱- ویژگی های ویریون
کوکوموویروس ها، ویروس هایی بیست وجهی(T=3) با قطر حدودا ۲۹ نانومتر هستند که درمجموع از ۱۸۰ زیرواحد پروتئینی و حدود ۱۸% آر.ان.ای تشکیل شده اند. این ویروس ها فاقد لیپید و یا گلیکوپروتئین ها هستند. ویریون ها با قطر داخلی ۵/۱۶ نانومتر، محتوی آر.ان.ای های ژنومی، حداقل یک آر.ان.ای زیرژنومی و در برخی گونه ها بیش از یک آر.ان.ای زیرژنومی بوده که بصورت جداگانه و مستقل کپسید پوشی می شوند. پیکره های کوکوموویروس در نتیجه واکنش های RNA-protian تثبیت شده و به راحتی در غلظت بالای نمک های خنثی کلراید و یا در حضور سدیم دودسیل سولفات از هم پاشیده شده (Kaper, 1975) و با کاهش غلظت نمک و یا حذف سدیم دودسیل سولفات به راحتی پیکره های فعال(از لحاظ بیولوژیکی) می توانند مجددا از پروتئین های پوششی قابل حل و آر.ان.ای شکل گیرند (Kaper,1969). همه ی پیکره ها ی ویروس ویژگی های رسوب^[۳۲] مشابه را دارند بنابراین امکان تفکیک آنها براساس خصوصیات فیزیکی میسر نیست و این پیکره ها در سه گونه کوکوموویروس توسط میکروسکوپ الکترونی قابل تشخیص نمی باشند. علی رغم تشابهات مورفولوژیکی و ویژگی های رسوب، پیکره های کوکوموویروس ها در کپسید پوشی آر.ان.ای ها متفاوتند. RNA-1وRNA-2 بطور جداگانه کپسیدپوشی می شوند، درحالیکه RNA-3 و RNA 4 زیر ژنومی احتمالا درون یک پیکره واقع می گردند (Habili & Francki, 1974a). پیکره هایی با ۳ نسخه از RNA-4 نیز ممکن است وجود داشته باشند (Kaplan & Palukaitis, 1998).
۲-۲-۲- ویژگی های ژنوم
ژنوم ویروس در این جنس از سه قطعه آر.ان.ای تک رشته ای مثبت که براساس کاهش اندازه به صورتRNA-1، RNA-2 و RNA-3 نامگذاری می گردند و یک یا چند آر.ان.ای زیرژنومی تشکیل شده است (شکل۲-۱). همه ی قطعات آر.ان.ای دارای یک ساختار کلاهک (۵΄cap) در انتهای ΄۵ خود می باشد. نواحی ΄۵ غیرکد کننده ی RNA-1 و RNA-2 درون یک نژاد، بسیار شبیه به یکدیگر می باشند. قسمت ΄۳ همه قطعات آر.ان.ای نیز درون یک نژاد بسیارمشابه بوده و قادر به تشکیل یک ساختار شبیه tRNA-like می باشند (Habili & Francki, 1974c). اندازه ی RNA های ژنومی و پروتئین های کد شده در بین گونه های مختلف متفاوت می باشد. RNA-1 حدودا ۳۴۰۰ نوکلئوتید طول داشته و پروتئین ۱a را کد می کند. قطعه RNA-2 به طول تقریبی ۳۰۰۰ نوکلئوتید کدکننده ی دو ORF یعنی ۲a و ۲b می باشد که تاحدودی با یکدیگر هم پوشانی دارند. پروتئین ۲b از آر.ان.ای زیرژنومی ۴A ترجمه و کپسیدپوشی میگردد . RNA-3به طول ۲۲۰۰ تا ۲۴۰۰ نوکلئوتید پروتئین های ۳a یا پروتئین حرکتی^[۳۳] با وزن مولکولی KDa30 و ۳b یا پروتئین پوششی با وزن مولکولی KDa24 را کد می نماید که این پروتئین (CP) از روی RNA-4 زیرژنومی نیز ترجمه می شود. RNA-3 و RNA-4 با هم کپسیدپوشی می شوند، اما RNA-4 جهت ایجاد آلودگی موردنیاز نیست. ORF مربوط به پروتیئن های ۱a، ۲a، ۳a و پروتئین پوششی در همه ی جنس های خانواده ی Bromoviridae یافت می شوند، درحالیکه ORF مربوط به پروتئین ۲b تنها در جنس های Cucmovirus و Ilarvirus وجود دارد. در جنس Cucumovirus رمز آغاز جهت ژن ۲b درجایگاه متفاوتی برای هرگونه قرار دارد (Xin et al., ۱۹۹۸).
۲-۲-۳- عملکرد پروتئین ها در جنس کوکوموویروس
۲-۲-۳-۱- پروتئین ۱a
پروتئین ۱a توسطRNA-1 کد می شود و جزئی از آنزیم رپلیکاز^[۳۴] می باشد. پروتئین ۱a دارای دو ناحیه عملکردی می باشد، ۱) قسمت ابتدائی پایانه ی آمینی^[۳۵] که در واقع یک ناحیه متیل ترانسفراز است و در کلاهک گذاری آر.ان.ای های ژنومی^[۳۶] و زیرژنومی درگیر است، ۲) ناحیه دیگر پایانه کربوکسیل^[۳۷] بوده که یک هلیکاز^[۳۸] می باشد .(Habili & Symons, 1989) ترادف های دخیل در بروز واکنش فوق حساسیت در گیاه توتون و ترادف ضروری برای انتقال با بذر در RNA-1 و احتمالاً در پروتئین ۱a قرار دارند. بر اساس بررسی های بعمل آمده مشخص گردیده که پروتئین ۱aبا ۶-آدنوزیل متیونین باند می گردد، پدیده ای که جهت متیلاسیون ساختار کلاهک انتهای ΄۵ ضروری است. ناحیه هلیکاز از تعدادی موتیف های مشخص هیکازها تشکیل شده است و حذف درون این موتیف های در ژن پروتئین ۱a از توانایی این پروتئین در عمل تکثیر ممانعت می نماید (Roossinck et al., 1995). قطعه RNA-1 در ویروس CMV بر سرعت آلودگی سیستمک در گیاه کدو اثر دارد. پروتئین CMV-1a بیان شده در گیاه توتون، به میزان اندک قادر به تکثیر ویروس بوده و اجازه حرکت قطعات RNA-2و RNA-3ی CMV را می دهد، بنابراین حتی سطوح خیلی پایین پروتئین ۱a جهت تکثیر کافی می باشد. پروتئین ۱a حفاظت شده ترین پروتئین در بین پروتئین های ویروس TAV می باشد (شکل ۲-۱) (Lakshman & Gonsalves, 1985).
۲-۲-۳-۲- پروتئین ۲a
پروتئین ۲a به وزن مولکولیKDa93 توسط RNA-2 کد میشود و از تعدادی موتیف مشخص RNA پلیمرازهای وابسته به ^[۳۹]RNA تشکیل شده است. هیچ جهشی در این ترادفها در هیچ یک از کوکوموویروس ها به منظور تعیین نقش آن ها در تکثیر ویروس انجام نشده است، در حالیکه چنین آزمایشاتی برای پروتئین ۲a کد شده توسط ویروس موزائیک یونجه^[۴۰] انجام گردیده است (Poch et al., 1989). در مورد CMV مشخص شده که ترادف های ۲a در مجاورت موتیف های D پلی مراز واکنش فوق حساسیت و آلودگی سیستمیک را در گیاه لوبیا چشم بلبلی نشان میدهند. همچنین ترادف های همراه با توالی موجود در موتیف B پلی مراز بر روی آلودگی سیستمیک در گیاه نخود فرنگی اثر میگذارد (Kim & Palukaitis, 1997). پروتئین ۲a در سیستم مخمری دی هیبرید و in vitro با پروتئین ۱a واکنش نشان می دهد. تنها ۱۲۶ اسید آمینه ناحیه انتهای آمینی پروتئین ۲a جهت چنین واکنشی بین پروتئین های ۱a و ۲a در محیط in vitro و in vivo مورد نیاز می باشد (Kim et al., 2002).
۲-۲-۳-۳- پروتئین ۲b
پروتئین ۲b توسط RNA-2 کد گردیده و از روی یک آر.ان.ای زیر ژنومی ((subgenomic.RNA تحت عنوان RNA-4A بیان می گردد. هر دو قطعه RNA-2 و RNA-4A ترادف کدکننده پروتئین ۲b را دارا بوده، اما در RNA-2 این توالی ترجمه نگردیده و تنها توسط آر.ان.ای زیرژنومی RNA-4A ترجمه و بیان می گردد. این پروتئین تنها در جنس های Cucmovirus و Ilarvirus وجود دارد (Xin et al., ۱۹۹۸). پروتئین ۲b در CMV و TAV، به عنوان فاکتور لازم جهت حرکت ویروس در مسافت های طولانی و مهار کننده خاموشی ژن پس از نسخه برداری^[۴۱] نقش دارد. این پروتئین توانایی سیگنال خاموشی ژن را جهت فعالسازی این مکانیزم در بافت های گیاهی را مهار می نماید (Lucy et al., 2000). حذف ۱۵ تا ۱۶ آمینو اسید از انتهای کربوکسیل این پروتئین در CMV از فعال سازی نسخه برداری، تجمع ویروس در برگ ها و بیان بیماریزایی، ممانعت نمود. همچنین وجود ۷ اسید آمینه در انتهای آمینی پروتئین ۲b بر روی سطح بیماری زایی و سطح تجمع ویروسی موثر می باشد. بیان پروتئین CMV-2b در حامل های ویروسی TMV یا PVX (در ویروس های موتانت شده ی TMV و PVX که محتوی ژن CMV-2b می باشند) بیماری زایی این ویروس ها را افزایش داد که این موضوع بیانگر آن است که احتمالا این پروتئین یک فاکتور سینرژیست می باشد. بر این اساس پروتئین ۲b ممکن است از پاسخ های دفاعی گیاه میزبان در برابر آلودگی ویروسی ممانعت نماید (Li et al., 1999). همچنین پروتئین ۲b جهت حرکت ویروس های نوترکیب شکل گرفته بین RNA-1 و CMV-RNA-2 و TAV-RNA-3 الزامی بوده و تا حدودی نیز نقش مستقیم در حرکت ویروسی دارد (Shi et al., 2002).
۲-۲-۳-۴- پروتئین ۳a (MP)
پروتئین ۳a یا پروتئین حرکتی توسط RNA-3 کد میگردد. جهت تکثیر ویروس نیازی به این پروتئین نیست، اما وجود آن جهت حرکت ویروس ضروری می باشد (Moreno et al., 1997b). پروتئین ۳a در پلاسمودسماتای^[۴۲] بین سلول های آلوده و همچنین به صورت توده های بزرگ در عناصر غربالی متمرکز میگردد. بررسی های موتاسیونی در CMV بیانگر آن است که برخی ترادف ها واکنش های بین گیاهان را به شیوه خاص–گونه ای^[۴۳] تنظیم می نماید. موتاسیون آمینواسیدهای ۵۱ و ۲۴۰ پروتئین ۳a سطح تجمع پروتئین را در توتون تا ۵۰ برابر افزایش داده و کارایی حرکت سیستمیک را بالا می برد. این در حالی است که توانایی همان ویروس را در حرکت سیستمیک، در گونهای دیگر از کدو مانع گردید. ضمنا موتاسیون در اسیدهای آمینه Asp20 یا Asp21 پروتئین حرکتی ویروس CMV، از تشکیل لکه های موضعی درChenopodium quinoa و لوبیا چشم بلبلی جلوگیری می نماید.(Blackman et al., 1998) پروتئین ۳a همچنین جهت حرکت درمسیرهای طولانی موردنیاز می باشد. موتانت های مختلف که حرکت سلول به سلول را تحت تاثیر قرار میدهند، قادر به تکمیل موتانت موثر حرکت در مسیرهای طولانی نمی باشند. لذا به نظر می رسد مولکول های یکسان پروتئین ۳a ، دخیل در یک فعالیت، لزوما در دیگر فعالیت های موردنیاز جهت حرکت ویروس نیز درگیرمی گردند (Li et al., 2001).
۲-۲-۳-۵- پروتئین پوششی (CP)
پروتئین پوششی یا ۳b توسط RNA-3 کد می شود، در حالیکه از طریق RNA-4 زیرژنومی بیان می گردد (Habili & Francki, 1974c). پروتئین پوششی وظیفه کپسسید پوشی آر.ان.ای های ویروسی را بر عهده دارد. این پروتئین همچنین جهت حرکت سلول به سلول ویروس در گیاه موردنیازمی باشد. یکسری فاکتورهای تعیین کننده در پروتئین پوششی، حرکت سلول به سلول را دربرخی از میزبانها تحت تاثیر قرار می دهند. این فاکتورها با سایر اجزا ویروسی درالقا حرکت سلول به سلول در میزبان نیز موثر میباشند. همچنین CP درحرکت در مسیرهای طولانی (Taliansky et al., 1995)، در انتقال ویروس به وسیله ی شتهها، بیان علائم و دامنه ی میزبانی نیز موثر میباشد (Raj et al., 2009).
۲-۳- ویروس بیبذری گوجه فرنگی در جهان
ویروس TAV برای اولین بار در سال ۱۹۴۶ تحت عنوان “یک بیماری ویروسی جدید از گیاه گوجه فرنگی” توسط Blencowe و Caldwell با علائم کوتولگی، عدم غنچه دهی و تولید میوه های بدون بذر از کشور انگلستان گزارش گردید. در سال ۱۹۴۹ نام Aspermy را به دلیل علائم واضحی که این ویروس در بیبذرکردن گوجه فرنگی ایجاد می نمودجهت این بیماری ویروسی پیشنهاد نمودند. Blencoweو Caldwell در سال ۱۹۴۶ گل های داوودی کشت شده در نزدیکی گیاهان گوجه فرنگی که دارای علائمی مشابه با ویروس های گوجه فرنگی بودند را به عنوان منبع اصلی و محل زمستان گذرانی ویروس معرفی نمودند. لذا گزارش Anisworth در سال ۱۹۳۹ (مبنی بر آلودگی گیاهان داوودی توسط استرینی از ویروس موزائیک خیار) مربوط به همین ویروس بوده است و پس از آن در سال ۱۹۵۱ نام Tomato aspermy virus برای ویروس ایجادکننده بیماری به کار برده شد (Govier, 1957). در دهه ی ۵۰ میلادی TAV باعث نابودی هزاران گیاه داوودی در انگلستان گردید (Grogan et al., 1963). در سال ۱۹۵۵ Hollings ویروس TAV را از روی گیاه داوودی توصیف نمود. Brierley در سال ۱۹۵۵ در آمریکا، بد شکلیهای شدید گل های داوودی را ناشی از ویروس TAV تشخیص داد و پس از آن نیز این ویروس از مناطق مختلف دنیا از جمله کشور های هلند (Noordam, 1952)، هند (Sastry et al., 1964)، فیلیپین (Ocfemia, 1956)، اسکاتلند (Govier, 1957)، نیوزلند (Procter, 1975)، روسیه (Chuyan & Krylor, 1979)، مجارستان (Salamon et al., 1976)، تایوان (Cheng, 2004)، ژاپن، استرالیا و کانادا Hollings & Stone, 1971)) گزارش گردید (جدول ۲-۲).
رابطه خویشاوندی TAV و CMV همواره مورد بحث و تبادل نظر محققین بوده است. اگرچه Blencowe (1949) & Caldwell و Hollings (1955)، بر مبنای آزمون های حفاظت تقاطعی و Grogan (1963) بر مبنای آزمونهای سرولوژیکی بیان نمودند که دو ویروس TAV و CMV با هم مرتبط نمیباشند، اما آزمونهای حفاظت تقاطعی Govier (1957)، Noodam(1952) و Van Slogteren (1958)، آزمونهای سرولوژیکی و دامنهی میزبانی گزارش شده توسط Lawson (1967) بیانگر رابطه خویشاوندی دور بین این دو ویروس می باشد. در دهه ی ۷۰ میلادی (۱۹۷۴a, 1974b, 1974c) Francki و Habili براساس مقایسه خصوصیات نژادهای Q-CMV و V-TAV (علی رغم وجود برخی خصوصیات مشترک) رابطه سرولوژیکی بین آن ها مشاهده نکردند. این در حالی است که در بررسی دیگری توسط Rao و همکاران در سال ۱۹۸۲ بر اساس آزمون الایزا و نشت ایمنی^[۴۴] مشخص گردید که دو ویروس مذکور دارای رابطه سرولوژیکی با یکدیگر می باشند. بنابراین نتایج متفاوت به دست آمده است توسط محققین در آزمونهای سرولوژیکی ناشی از تفاوت نژادهای موجود در بین دو ویروس CMV و TAV و همچنین نحوه تهیه ی آنتی سرم می باشد(Rao et al.,1982) . اولین مطالعات مولکولی در مورد این ویروس در سال ۱۹۸۱ با تکثیر انتهای ΄۳ آر.ان.ای ۳ دو نژاد V-TAV و N-TAV این ویروس صورت گرفته است. در دهه ی نود میلادی با پیشرفت مطالعات ملکولی، طول کامل ژنوم نژاد V-TAV تکثیر و تعیین توالی گردید (Moriones et al., 1991). همچنین در سال ۱۹۹۷ یک ژن هم پوشان جدید (۲b) و یک گروه از آر.ان.ای های زیر ژنومی جدید (۳B,4A) جهت این ویروس معرفی گردند (shi et al., 1997, 1997a).
۲-۳-۱- سازماندهی ژنوم ویروس بیبذری گوجه فرنگی
ژنوم TAV متشکل از ۳ قطعه آر.ان.ای تک رشته ای مثبت و ۴ قطعه آر.ان.ای زیر ژنومی
می باشد. طول کامل ژنوم ویروس بین ۸۷۰۰ تا۸۸۰۰ نوکلئوتید می باشد (شکل ۲-۱) (Shi et al., 1997a).
۲-۳-۲- آر.ان.ایهای ژنومی
۲-۳-۲-۱- قطعه RNA-1
قطعه RNA-1 ویروس TAV به طول ۳۴۱۲ جفت باز، دارای یک ORF بوده و کد کننده پروتئین ۱a با وزن مولکولی KDa111 می باشد. ژن ۱a در موقعیت نوکلئوتیدی ۹۵ تا ۳۰۷۶ به طول ۲۹۸۱ نوکلئوتید متشکل از ۹۹۳ اسید آمینه می باشد. RNA-1 دارای سه ناحیه حفاظت شده انتهای آمینی، انتهای کربوکسیلی و ناحیه مرکزی بوده که هر دو انتهای حفاظت شده ی کربوکسیلی (C-terminal) و آمینی (N-terminal) مربوط به پروتئین ۱a، در سنتز RNA های ویروس نقش دارند (Choi et al., 2001). انتهای آمینی این پروتئین شامل ناحیه Methytransferase domain می باشد که دارای سه ناحیه حفاظت شده و انتهای کربوکسیلی Helicase domain با ۷ ناحیه حفاظت شده می باشند. این نواحی در بالاخانواده ی Alphavirus-like شناسایی گردیده اند (Koonin and Dolja, 1993). در هر جدایه مربوط به TAV ترادف های غیر کدکننده انتهای ΄۵ در RNA-1 و RNA-2 و ناحیه غیر کد کننده انتهای ΄۳ در RNA-1، RNA-2 و RNA-3 بسیار حفاظت شده می باشند. توالی و طول ناحیه ΄۳ و ΄۵ در RNA-1 بسیار مشابه RNA-2 می باشد (Roossinck et al., 1991). همچنین۴۰ نوکلئوئید حفاظت شده در قسمت غیرقابل ترجمه^[۴۵]، در انتهای ΄۳ RNA-1 در این ویروس وجود دارد (جدول ۲-۳) (Choi et al., 2001).
۲-۳-۲-۲- قطعه RNA-2
قطعه RNA-2این ویروس به طول ۳۰۷۴ جفت باز دی سیسترونیک بوده و کد کننده پروتئین های ۲a و ۲b می باشد. پروتئین ۲a یک RdRP است که از نوکلئوتید ۸۸ با رمز آغازین ATG شروع و تا نوکلئوتید ۲۵۷۴ ترجمه میگردد. ۸ ناحیه حفاظت شده RdRP در بین نوکلئوئیدهای ۱۴۱۱ تا ۲۱۱۲ در قسمت مرکزی پروتئین ۲a قرار دارند. انتهای کربوکسیلی در جدایه های مختلف دارای تغییرات کمی می باشد (Choi et al., 2001). ویروس TAV دارای آر.ان.ای ماهواره ای^[۴۶] نمی باشد اما قادر به تکثیر آر.ان.ای ماهواره ای ویروس CMV بوده و میتواند به عنوان یک ویروس کمکی^[۴۷] آر.ان.ای ماهوارهای ویروس CMV عمل نماید (Rezaian et al., 1985).
پروتئین همپوشان ۲b در RNA-2 در موقعیت های نوکلئوتیدی ۲۴۴۷ تا ۲۷۳۴ و از طریق آر ان ای زیرژنومی ۴a بیان می گردد. توالی این پروتئین درمیان تمام پروتئین های کوکومووبروسها از همولوژی کمتری برخوردار می باشد (Ding et al., 1994). ضمنا انتهای ΄۵ در RNA-2 یک ناحیه غنی از پیریمیدین بوده و تا نوکلئونید ۸۷ (ابتدای (ORF 2a ادامه دارد. همچنین پراکندگی اسیدآمینههای بازی و اسیدی در RNA-2-TAV مشابه CMV بوده و اسید آمینههای اسیدی در انتهای آمینی و بازی در انتهای کربوکسیلی قرار دارند (Moriones et al., 1991).
محصولات ژنی RNA-1 و RNA-2 به دلایل زیر در همانندسازی ویروس دخالت دارند: (۱) این دو RNA در غیاب RNA3 می توانند همانند سازی نمایند. (۲) توالی اسید های آمینه این دو RNA با پروتئین موجود در سایر ویروس ها که دارای عمل RNA پلیمراز می باشند، مشابه می باشند. (۳) جهش های مشخصی در RNA2 از همانند سازی ویروس جلوگیری می نماید (جدول ۲-۳) (Matthews et al., 1999).
۲-۳-۲-۳- قطعه RNA-3
قطعه RNA-3 ویروس TAV به طول۲۲۲۲ تا ۲۳۸۶ جفت باز دارای دو ORF و کدکننده پروتئین های ۳a و CP بوده (Palukaitis & Garcia-Arenal, 2003) که به وسیله ی ناحیه بین ژنی^[۴۸] به طول ۲۹۵ نوکلئوتید از یکدیگر جدا می گردند. ناحیه بین ژنی حاوی ناحیه کنترل داخلی^[۴۹] بوده و همانند موقعیت های حفاظت شده ی مربوط به سنتز آر.ان.ای زیرژنومی CMV و BMV در این ویروس نیز لازم می باشد (Boccard & Baulcombe, 1993). بر پایه مقایسه توالی ناحیه بین ژنی RNA-3ی ویروس بی بذری گوجه فرنگی، این ویروس بیشترین درصد تشابه نوکلئوتیدی را با ویروس PSV (در مقایسه با ویروس CMV) دارا بوده است (Choi et al., 2001). یک اسیدآمینه سرین (به شدت حفاظت شده) در موقعیت آمینواسیدی چهار پروتئین حرکتی این ویروس واقع گردیده که بر میزان حرکت ویروس و شدت علائم (به جز استرین V-TAV که دارای رمز پایان UAA است) اثر دارد (Moreno et al., 1997).
ناحیه غیرقابل ترجمه ی انتهای ΄۵ در RNA-3 مانند دیگر کوکوموویروس ها شامل ناحیه حفاظت شده UG tract میباشد. این ناحیه جهت تجمع RNA-3 ویروس لازم می باشد. همچنین علی رغم اینکه ویروس TAV دارای آر.ان.ای ماهواره ای نمیباشد، اما RNA-3 این ویروس قادر به تکثیر آر.ان.ای ماهواره ای CMV می باشد (Hu et al., 1997). انتهای ΄۳ قطعه RNA-3 دارای یک توالی حفاظت شده به طول ۱۶۰ نوکلئوتید با دو تکرار متوالی بوده، که در برخی استرینهای این ویروس یک تکرار از آن حذف گردیده است (جدول ۲-۳) .(Shi et al., 1997a)
۲-۳-۳- آر.ان.ایهای زیرژنومی
قطعه RNA-4 ویروس TAV به طول ۱۳۰۳ نوکلئوتید کد کننده پروتئین پوششی می باشد. این آر.ان.ای دارای انتهای ΄۳ یکسان با انتهای ΄۳ قطعه RNA-3 می باشد و همراه با RNA-3 کپسید پوشی می گردد. RNA-4A به طول ۷۰۲ نوکلئوتید مشابه انتهای ΄۳ قطعه ی RNA-2 بوده و پروتئین ۲b کد شده توسط RNA-2 را بیان می نماید (Shi et al., 1997b). RNA-4 به جز در ویروس TAV در دو گونه ی دیگر از جنس کوکوموویروس نیز وجود دارد، درحالی که RNA-4A در نژاد های زیرگروه CMV-I موجود نیست (Blanchard et al., 1997).
علاوه بر آر.ان.ایهای زیر ژنومی ۴ و ۴A، RNA های زیرژنومی دیگری نیز از ژنوم ویروس TAV مشتق گردیده اند. RNA-3B و RNA-5 به ترتیب به طول های ۴۸۶ و ۳۲۳ نوکلوتید از انتهای ΄۳ قطعه ی RNA-3ی استرین V-TAV مشتق می گردند. RNA-3B حاوی دو تکرار متوالی از ۱۶۳ نوکلئوتید در انتهای ΄۳ قطعه RNA-3 می باشد. در حالیکه RNA-5 حاوی یک تکرار از این توالی بوده است. توالی نوکلئوتیدی این دو RNA ی زیرژنومی، به جز در یک نوکلئوتید، کاملا با هم یکسان می باشند. بر خلاف RNA-4 و RNA-4A که به ترتیب پروتئین پوششی و پروتئین ۲b را کد می نمایند، RNA-5 و RNA-3B یک گروه جدید از RNAهای زیر ژنومی TAV می باشند که به عنوان mRNA عمل نمی نمایند (shi et al., 1997a).
۲-۴- دامنه میزبانی و علائم ویروس بیبذری گوجه فرنگی
ویروس TAV گسترش جهانی داشته و در کشتهای داوودی ایجاد آلودگی می نماید این در حالی است که در کشتهای گوجه فرنگی کمتر یافت می گردد. این ویروس درمیزبانهای دیگری از قبیل آهار، فلفل، سنبل، اختر، سوسن، گلایول، نعناع، تاج خروس، آفتابگردان، توتون و گل استکانی ایجاد بیماری می کند. TAV به سختی ازطریق مکانیکی به گیاه داوودی منتقل
می شود، اما در اکثر گیاهان توتون درشرایط آزمایشگاهی ایجاد آلودگی می نماید (Raj et al., ۲۰۱۱; Zhou et al., ۱۹۹۰; Hollings & Stone, 1971).
۲-۴-۱- دامنه میزبانی ویروس بیبذری گوجه فرنگی بر روی گیاهان آزمون
این ویروس دامنه میزبانی وسیعی بر روی گیاهان آزمون دارد و بیش از ۱۰۰ گونه در ۲۴ خانواده دو لپه ای و ۳ خانوداه تک لپه ای را آلوده می نماید. حداقل ۷۵ گونه از این میزبان ها در خانواده های Compositae، Solanaceae و Chenopodiaceae قرار دارند. نژاد تیپ این ویروس (TAV-B) نسبت به اکثر جدایه های داوودی موجود، دامنه میزبانی محدودتری دارد (Hollings & Stone, 1971).
۲-۴-۲- گیاهان تشخیصی ویروس ویروس بیبذری گوجه فرنگی