بررسی تنوع ژنتیکی
از آنجایی که فرضیات مختلف توجیه کننده هتروزیس نظیر غالیبت و فوق غالبیت وجود یک رابطه مثبت بین تعداد مکان ژنی هتروزیگوس یک صفت و عملکرد و کارایی هیبرید را تایید می کند بنابراین یک راه تخمین مقادیر ترکیب پذیری خصوصی و هتروزیس،تخمین عملکرد هیبرید ها قبل از انجام تلاقی ها و ارزیابی های مزرعه ای از طریق تعیین فاصله ژنتیکی والدین با بهره گرفتن از صفات مورفولوژیک یا دادهای مارکر می باشد (لامکی، ۱۹۹۳). همچنین طراحی و اجرا ی یک برنامه اصلاح نباتات برای اصلاح یک صفت کمی تا حد زیادی به میزان تنوع ژنتیکی ژرم پلاسم بستگی دارد.مطالعه پلی مورفیسم در میان ژرم پلاسم فرصت گزینش والدین مناسب جهت تلاقی را فراهم می آورد.انتظار می رود این والدین در تلاقی با هم نتاج برتری نتاج برتری تولید کرده و میانگین صفت را در جمعیت بالا ببرند. همچنین بررسی تنوع ژنتیکی و تعیین فاصله ژنتیکی نسبی موجود بین یا جمعیت ها در برنامه های اصلاحی اهمیت ویژه ای دارد زیرا سازمان دهی ژرم پلاسم و گزینش بطور موثری انجام می شود. در آغاز یک برنامه اصلاحی آگاهی از روابط خویشاوندی و فیلوژنی در میان ژنوتیپ هاتکمیل کننده اطلاعات فنوتیپی در پیشبرد اصلاح جمعیت ها است.همچنین اطلاع از شباهت های ژنتیکی در میان ژنوتیپ ها موجب می شود انتخاب والدین در یک تلاقیبطور موثر تری انجام پذیرد و هتروژیس خوبی بروز پیدا کند بنابراین شناسایی سریع و قابل اطمینان ژنوتیپها برای انجام برنامه های اصلاحی و همچنین پروژه های تولید بذر در محصولات زراعی ضروری است (نولی،۱۹۹۹).

روش های آماری بررسی تنوع ژنتیکی
به منظور مطالعه تنوع ،عموماً از ضرایب تغییرات ژنتیکی (GCV)^[20] و ضریب تغییرات فنوتیپی (PVC)^[21]استفاده می شود.مطالعه تنوع ژنتیکی فرایندی است که تفاوت بین افراد،جمعیتها و یا گرو هها با بهره گرفتن از روش های آماری خاص بر اساس داده های حاصل از ارزیابی صفات مختلف بررسی می شود. تنوع ژنتیکی می تواند بر اساس صفات مورفولوژیک (کیفی و کمی )، شجره افراد و یا خصوصیات مولکولی افراد بیان شود.هر چند صفات مورفولوژیکی و شجره ای به عنوان معیارهایی در مطالعه تنوع ژنتیکی در جمعیت های گیاهی و جانوری مورد استفاده قرار گرفته اند ولی در سالهای اخیر با پیشرفت در زمینه ژنتیک مولکولی و بیوتکنولوژی ، مارکر های مولکولی به عنوان ابزاری کارا در بررسی تنوع ژنتیکی مطرح شده اند (یو ،۱۹۹۳).
عموماً روش های متداول برای شناسایی و بررسی های ژنتیکی مبتنی بر مشاهدات فنوتیپی بوده و از این جهت فاقد الگو های تنوع ژنتیکی در سطح ژنوم می باشند. علاوه بر این به دلیل ماهیت پلی ژنی بسیاری از این صفات و اثر عوامل محیطی نیاز به جمع آوری داده های فراوان در مکانهای مختلف بوده و در بعضی موارد میزان پلی مورفیسم برای برخی صفات مورفولوژیک بسیار محدود می باشد.از این لحاظ سایر روشها علاوه بر روش های مبتنی بر صفات مورفولوژیک مورد استفاده قرار می گیرند (نولی ،۱۹۹۹). روش های مختلفی برای بررسی تنوع ژنتیکی ابداع شده است که در ذیل به برخی از آنها اشاره می شود :
تجزیه کلاستر
تجزیه کلاستر یکی از متداول ترین روش های چند متغیره در بررسی تنوع ژنتیکی و گروه بندی افراد می باشد .این روش در مواردی استفاده می شود که الگوی گروه بندی قبلی برای افراد وجود نداشته باشد. الگوریتم های مختلفی برای تجزیه کلاستر پیشنهاد شده است.این الگوریتمها به دو گروه اصلی تقسیم می شوند (۱) روش های مبتنی بر فاصله یا شباهت بین افراد یا ژنوتیپ ها برای گروه بندی استفاده می شود.(۲) روش های مبتنی بر مدل که در آنها فرض بر این است که افراد درون هر کلاستر مشاهدات تصادفی از برخی مدلهای پارامتری بوده و استنباط های آماری مربوط به پارامتر های هر کلاستر با بهره گرفتن از روش های آماری استاندارد مانند حداکثر درست نمایی انجام می گیرد.در مطالعات ژنتیکی بیشتر روش های مبتنی بر فاصله بخصوص الگوریتم های طبقاتی استفاده می شوند (فرشاد فر،۱۳۷۷).
تجزیه به مولفه های اصلی
در کنار تجزیه کلاستر PCA^[22] از متداول ترین روش های آماری چند متغیره در مطالعات ژنتیکی برای گروه بندی و بررسی تنوع می باشد. هدف از این تجزیه یافتن ترکیباتی ازP متغیر جهت ایجاد شاخص های غیر مستقل بنام مولفه های اصلی است.در تجزیه به مولفه های اصلی با بهره گرفتن از داده های مارکر های مولکولی بایستی توجه داشت که نمایش گرافیکی و گروه بندی بر اساس دو یا سه PCA نمی تواند نشان دهنده تغییرات کل متغیر های اولیه باشد . در نتیجه توصیه می شود که گروه بندی بر اساس تعداد زیاد PCA که تغییرات بیشتری را توجیه می کنند انجام گیرد (فرشاد فر، ۱۳۷۷).
معیار های فاصله یا شباهت ژنتیکی
فاصله یا شباهت ژنتیکی بین ژنوتیپها یا جمعیت ها می تواند بسته به نوع صفات مورد مطالعه و داده های حاصله با بهره گرفتن از روش های مختلف برآورد شود. در مورد داده های حاصل از صفات کمی فاصله اقلیدسی یکی از متداول ترین معیار های برآورد فاصله ژنتیکی است. برای صفات کیفی یا داده های مارکر که بصورت صفر و یک بیان می گردند،ضرایب متعددی برای برآورد فاصله یا شباهت به کار برده می شوند. از این معیار ها می توان به ضریب شباهت ژاکارد^[۲۳] ،ضریب نی و لی^[۲۴] ،ضریب تطابق ساده^[۲۵] و ضریب تغییر یافته روگر اشاره کرد. برای ژنوتیپهای هموزیگوس یا مواد ژنتیکی خالص ضریب ژاکارد و نی نتایج مشابهی برای مارکر های غالب و هم بارز خواهند داشت.ولی در صورتیکه مواد ژنتیکی هتروزیگوس باشند با توجه به اینکه با مارکر های غالب امکان تمایز افراد هموزیگوس از هم وجود ندارد،بنابراین ضرایب نی و ژاکارد برآورد متفاوتی از شباهت ژنتیکی خواهند داشت(رحیمی نژاد، ۱۳۸۵).
روش های برآورد تنوع ژنتیکی با بهره گرفتن از نشانگرها
توسعه ژنتیکی گونه ها و ژنوتیپ ها از طریق روش های اصلاحی به توانایی تشخیص و تفکیک اثرات ژنتیکی از اثرات محیطی بستگی دارد. انتخاب به کمک نشانگر ها شرایط مناسبی را برای انتخاب سریع و کاهش جمعیت اولیه ایجاد می کند (استاب و همکاران،۱۹۹۶). نشانگر ها را می توان به سه گروه مورفولوژیکی، بیوشیمیایی و مولکولی تقسیم بندی نمود.اگر بیان خصوصیات مورفولوژیکی در طیفی از شرایط محیطی قابل تکرار باشد، می توانند بعنوان نشانگر ژنتیکی مورد استفاده قرار گیرند. ولی از آنجا که نشانگرهای مورفولوژیکی تحت تاثیر محیط قرار می گیرند این امر می تواند بیان ژنها را تحت تاثیر قرار دهد. این نشانگرها غالباً متاثر از سن و مرحله رشدی گیاه هستند و تعدادشان نیز کم می باشد که این امر کارایی نشانگر های مورفولوژیکی را بعنوان نشانگر ژنتیکی کاهش می دهد.علاوه بر این گاهی برای مشاهده و ثبت آنها باید منتظر ظهورشان شد که در گیاهان چند ساله مشکل است (استاب و همکاران،۱۹۹۶).
بررسی تنوع ژنتیکی یک گونه گیاهی از طریق صفات مورفولوژیکی قابل محاسبه است.تنوع ژنتیکی تعدادی از ژرم پلاسم های گلرنگ از طریق صفات مورفولوژیک توسط آشری (۱۹۷۵)، سنگام و همکاران (۲۰۰۵)،جارادات و شهید(۲۰۰۶)، خان و همکاران (۲۰۰۵) و امینی و همکاران (۲۰۰۷) مورد بررسیقرار گرفته است . تحقیقات متعددی در زمینه رابطه بین اجزای عملکرد دانه انجام گرفته است.پاسگال و آلبورکرک (۱۹۹۶)در مطالعه ۲۳ ژنوتیپ گلرنگ نتایج زیر را منتشر کردند.الف) همبستگی مثبتی بین تعداد شاخه در بوته با ارتفاع کل گیاه و با تعداد دانه در غوزه پیدا شد. ب )همبستگی منفی بین وزن هزار دانه با تعداددانه در غوزه و زود رسی مشاهده شد.ج) عملکرد دانه با تعداد غوزه در بوته، تعداد شاخه در بوته و با ارتفاع گیاه همبستگی مثبت داشت.
برادران و زینال (۱۳۷۵)گزارش نمودند که عملکرد دانه بالاترین همبستگی را با تعداد دانه در غوزه دارد، در حالیکه صفات وزن صد دانه، ارتفاع گیاه،تعداد دانه در غوزه و میزان روغن همبستگی بالایی با عملکرد دانه ندارند. چاوهاری (۱۹۹۰) در مطالعه صفات مرتبط با عملکرد دانه نتیجه گیری نمود که با گزینش برای تعداد غوزه در بوته وتعداد دانه در بوته می توان به بیشترین پیشرفت اصلاحی نایل آمد. باقری و همکاران (۱۳۸۰) در یک پژوهش بر روی ۱۲۱ ژنوتیپ گلرنگ گزارش نمودند که عملکرد دانه با صفات تعداد غوزه در گیاه، ظهور اولین گل و تعداد دانه در غوزه همبستگی مثبت دارند.آنها همچنین گزارش نمودند که تعداد غوزه در گیاه بیشترین تاثیر را روی عملکرد دانه تک بوته دارد.
روجاس و همکاران (۱۹۹۳) در مطالعه بر روی ۱۸۸ ژنوتیپ حاصل از یک کلکسیون جهانی گلرنگ گزارش کردند که وزن صد دانه بین ۶/۶-۹/۱ گرم متغیر بود و میانگین آن ۲/۴ گرم بدست آمد. همچنین این ژنوتیپ ها تنوع زیادی در میزان پوسته دانه (۶۰-۲۲ درصد )را نشان دادند که جهت استفاده در برنامه های اصلاحی آینده مفید خواهد بود.دهارو در مطالعه یک کلکسیون جهانی گلرنگ بر روی ۱۹۹ رقم گزارش کردند که وزن صد دانه بین ۵۸/۶-۹۲/۱ با میانگین آن ۲۱/۴ گرم می باشد. ژنوتیپ های ایرانی و عراقی برای این صفت حداقل مقدار را نشان دادند در حالیکه ژنوتیپ های هندی حداکثر وزن صد دانه را داشتند. آلبا و همکاران (۱۹۸۷) تنوع موجود در بین جوامع گلرنگ با منشاء های مختلف جغرافیایی را بررسی کردند. در این مطالعه آنها تعداد ۶۰ ژنوتیپ از هشت منشاء جغرافیایی مختلف را بصورت تصادفی انتخاب و در قالب طرح بلوک کشت نمودند و ۱۴ صفت را اندازه گیری کردند. بیشترین تنوع فنوتیپی مربوط به صفاتی همچون تعداد شاخه های اولیه، ثانویه،و ثالثیه، تعداد غوزه های روی شاخه های فرعی و عملکرد دانه بود. صفاتی مانند ارتفاع گیاه، وزن صد دانه، درصد جوانه زنی بذرها، طول دانه و کیفیت دانه (روغن و پروتئین ) درصد پایینی از تنوع را نشان دادند.
جارادات و شهیدی (۲۰۰۶) هفت صفت مورفولوژیکی را در ارقام گلرنگ اندازه گیری کردند. آنها کمترین و بیشترین تنوع را به ترتیب برای طول دوره روزت و خار یا بدون خار بودن ارقام به مقدار ۱۴ درصد و ۵۰ درصد گزارش نمودند .
گریوانی و همکاران (۱۳۸۸) در یک تحقیق بر روی ۲۵ ژنوتیپ گلرنگ گزارش کردند که توارث پذیری عمومی صفات تعداد روز تا گلدهی،وزن صد دانه و ارتفاع گیاه بالاست و توارث پذیری عملکرد دانه نیز نسبتاً بالا می باشد در حالیکه بیوماس و تعداد روز تا رسیدگی وراثت پذیری عمومی کمی داشتند. امینی و همکاران (۲۰۰۷) با بررسی ۳۲ ژنوتیپ گلرنگوراثت پذیری عمومی وزن صد دانه و تعداد روز تا ۵۰ درصد گلدهی را بیشتر از سایر صفات گزارش کردند. آنها همچنین وراثت پذیری عمومی تعداد روز تا سبز شدن و تعداد طبق در گیاه را به ترتیب ۳۳/۶۹ و ۵۰/۶۹ درصد گزارش نمودند.
قدرتی (۱۳۷۶) نیز وراثت پذیری وزن صد دانه و طول شاخه های فرعی ژنوتیپ های گلرنگ را به ترتیب ۹۰ و ۷ درصد گزارش کرد. وی اعلام نمود که صفات مورفولوژیک قادر به شناسایی ژنوتیپ ها از یکدیگر نیستند ولی قادر به دسته بندی ارقام بر اساس منطقه جغرافیایی می باشند.الفدل و همکاران (۲۰۰۹) در بررسی ۲۰۰ ژنوتیپ گلرنگ از ۱۱ منطقه متفاوت دنیا نشان دادند که ضریب تغییرات برای ۱۲ صفت فنوتیپی اندازه گیری شده بین ۹/۲ تا ۹۱ درصد بود. صفات عملکرد دانه در یک متر مربع ، عملکرد تک بوته و تعداد دانه در بوته بیشترین تغییرات را داشتند. قابلیت توارث صفات بین ۱۰ درصد (ورس) و ۸۶ درصد (ارتفاع گیاه ) اندازه گیری شد. تعداد دانه در بوته و وزن هزار دانه همبستگی بالایی با عملکرد دانه داشتند و گزینش برای این صفات برای اصلاح عملکرد دانه و میزان روغن مفید است. نتیجه تجزیه به مولفه های اصلی نشان داد که ۷۸ درصد از تنوع فنوتیپی در ژرم پلاسم گلرنگ بر اساس چهار مولفه اصلی توضیح داده می شود. تجزیه کلاستر نشان داد که توزیع ژنوتیپ ها در داخل دسته ها با الگوی جغرافیایی مطابقت ندارد.
مهمترین عامل در استفاده از روغن های گیاهی ترکیب اسید های چرب آن است که هر چه میزان اسید چرب اشباع نشده بیشتر باشد کیفیت بالاتری دارد و برای سلامتی مفیدتر است (فرناندزمارتینر،۲۰۰۲). روغن گلرنگ عمدتاً شامل دو اسید چرب اشباع نشده اوائیک و لینولئیک است که بالغ بر ۹۰ در صد اسید چرب دانه را شامل می شود و بقیه آن مربوط به اسید چرب اشباع پالمتیک و استئاریک است (نولز،۱۹۸۹). داگلاس و همکاران (۲۰۰۴) اظهار داشتند که ۳۳ درصد از تغییرات درصد روغن ناشی از اثرات عوامل محیطی، تاریخ کاشت و مدیریت در طول دوره رشد گیاه است و ۶۷ درصد دیگر تغییرات، وابسته به فاکتورهای ژنتیکی است.فرناندز و همکاران (۱۹۹۳) با بررسی ترکیب اسید های چرب ۲۰۰ رقم گلرنگ گزارش کردند که دامنه تنوع اسیداولئیک ۶/۹۰-۷/۳ درصد و اسید لینولئیک ۸/۸۸-۹/۳ درصد است.
دهارو(۱۹۹۱) در یک بررسی گزارش نمود که مقدار روغن ارقام مورد بررسی گلرنگ بین ۸/۶۵-۲/۱۹ درصد متغیر بود که تعدادی از ارقام عراقی،هندی و پاکستانی حداکثر مقدار این صفت را از خودشان نشان دادند.میانگین اسید پالمتیک ۱/۷ (دامنه ۹-۶/۴) درصد و اسید استئاریک دارای میانگین ۲/۳ (دامنه ۶/۷-۳/۱) درصد بود. بالاترین مقدار اسید استئاریک در ژنوتیپ های افقانستان مشاهده شد. اسیداولئیک و اسید لینولئیک دامنه تنوع زیادی به ترتیب ۲/۸۴-۵/۹ درصد و ۸۰-۱/۹ درصد را نشان دادند. این تنوع و نحوه توزیع آنها در ژنوتیپ ها اشاره به ژنهای مشمول افزایش مقدار اسید اولئیک و یا سایر ژنهای کنترل کننده آن در کلکسیون مورد مطالعه دارد. بیشترین مقدار اسید اولئیک در ژنوتیپ های کنیا و اردن مشاهده شد و برای اسید لینولئیک در یک ژنوتیپ از کشور پرتقال اندازه گیری شد.خان وهمکاران (۲۰۰۳) با مطالعه ۱۹۳ ژنوتیپ از هشت منطقه دنیا (جنوب غربی آسیا، شرق اروپا، مرکز شرق اروپا، آفریقا ، مدیترانه، شرق آسیا و آمریکای شمالی ) تنوع زیادی در صفات مورفولوژیکی (تعداد روز تا گلدهی و ارتفاع گیاه، رنگ گل، اندازه غوزه ) و اسید های چرب مشاهده نمودند.تغییرات اسید اولئیک ۴/۲۹-۸/۷ درصد و اسید لینولئیک ۶/۸۳-۲/۶۲ درصد و اسید پالمتیک ۸/۱۲-۸/۱ درصد بود. مقدار اسید لینولئیک و تعداد روزها تا رسیدگی بین مناطق مختلف تفاوت زیادی معنی داری را نشان داد. نتایج تمام محققان نشان داد که تغییرات ژنتیکی بین ارقام گلرنگ وجود دارد که می تواند در برنامه های اصلاحی و انتخاب مستقیم برای کلکسیون های ژرم پلاسم این گیاه مورد استفاده قرار گیرد.
برخی از تفاوت های موجود در ردیف های DNAبین دو موجود، ممکن است به صورت پروتئین هایی با اندازه های مختلف ظاهر گردد،که از طریق شیمیایی قابل ثبت و مطالعه می باشند. در دهه ۱۹۵۰ آیزوزایم ها، بطور گسترده ای در بررسی تنوع ژنتیکی و طبقه بندی گیاهان بکار گرفته شدند. از معایب این نشانگرها ، محدود بودن روش های رنگ آمیزی پروتئین،و تعداد و پایین بودن تنوع ژنتیکی قابل ثبت در آنها است. همچنین آیزوزایم ها ،در گیاه در زمان خاصی بیان می گردند،بنابراین استخراج پروتئین باید در زمان خاصی و از بافت ویژه ای صورت گیرد که این امر خود نوعی محدودیت زمانی برای استفاده از سیستمهای آیزوزایمی است (عبدمیشانی و بوشهری، ۱۳۷۶ و نقوی و همکاران،۱۳۸۶).در مورد نشانگرهای DNAاصول و کاربرد آنها تفاوت قابل ملاحظه ای با نشانگرهای مورفولوژیک و پروتئینی ندارد، اما تحولی که در زمینه کشاورزی به خصوص در اصلاح نباتات ایجاد کرده است به دلایل زیر باشد.
۱-فراوانی فوق العاده این دسته از نشانگرها ۲- عدم تاثیر گذاری آنها از شرایط محیطی ۳- امکان به کارگیری آنها در مراحی اولیه رشد گیاه ۴- فراهم نمودن امکان مطالعه گیاهان در خارج از فصل و محل کشت ۵- دقت و قابلیت بالای تفسیر نتایج ۶- همبارز بودن اکثریت آنها ۷- سهولت تعقیب نشانگرها در نتاج و تعیین الگوی توارثی آنها ۸- امکان استفاده از آنها در مورد گونه های منقرض شده ۹- سهولت تشخیص گیاهان ناخالص از خالص ۱۰- سهولت امتیازدهی و تجزیه و تحلیل نتایج ۱۱- دسترسی به نرم افزارهای قوی برای تجزیه و تحلیل و تفسیر سریع نتایج. نشانگرهایDNA را می توان به دو دسته نشانگرهای مبتنی بر PCRو نشانگرهای مبتنی بر هیبریداسیون تقسیم بندی نمود. زمینه های کاربرد این نشانگرها شامل انگشت نگاری DNA به منظور شناسایی ارقام و واریته های گیاهی، مطالعات فیلوژنتیکی و تنوع ژنتیکی، تهیه نقشه های ژنومی به منظور انتخاب به کمک نشانگر ها می باشد (نقوی و همکاران ۱۳۸۶ و قره یاضی،۱۳۸۰).
کاربرد نشانگرهای مولکولی و یا بعبارت دیگرDNA، بسیاری از مشکلات مرتبط با نشانگرهای مورفولوژیکی و آیزوزایمی را برطرف می کند. این دسته از نشانگرها از طریق تجزیه و تحلیل مستقیم DNA قابل رویت هستند (گودوین ،۱۹۹۷). اولین نشانگرDNA،که در گیاهان استفاده شد نشانگر RFLP بود(بوتستین و همکاران ،۱۹۸۰). این تحول از پیامد های کشف آنزیم های برش دهنده بود. نشانگرهای DNA در مدت یک دهه تکامل شگرف و تحسین برانگیزی داشته اند. انواع مختلف نشانگرهای DNAبا تفاوت های زیادی از نظر تکنیکی و روش تولید، نحوه امتیاز بندی و تفسیر نتایج به سرعت ابداع و معرفی گردیدند. بدون شک ابداع و معرفی واکنش زنجیره ای پلیمراز(^[۲۶]PCR ) بیشترین نقش را در توسعه و تکامل نشانگرهای DNA داشته است. سپس نشانگرهای مبتنی بر واکنش زنجیره ای پلیمراز همانندRAPD(ویلیامز،۱۹۸۶)؛ SSR (لیت و لوتی،۱۹۸۹)؛AFLP (وس،۱۹۹۵)؛ ISSR (زیتکی ویز و همکاران،۱۹۹۴) و غیره معرفی شدند.
نشانگر مولکولی ISSR^[27]
مطالعات قبلی نشان می دهدکه تنوع ژنتیکی پایینی برای ژنوتیپ ها و جنس های گلرنگ با بهره گرفتن از نشانگرهای RAPD(ویلاترسانا و همکاران، ۲۰۰۵ و معالی امیری و همکاران ،۲۰۰۱) SNP(چاپمن و همکاران ۲۰۰۷) و VNP (بولس و همکاران ،۲۰۱۰) اندازه گیری شده است. بنابراین استفاده از یک نشانگر جدید برای بررسی تنوع ژنوتیپها وجنس های گلرنگ ضروری است .ISSR یک سیستم نشانگرمناسب برای کاندید شدن است (الگرن،۲۰۰۴).
روش ISSR-PCR برای اولین بار توسط زیتکی ویز و همکاران در سال ۱۹۹۴ معرفی شد. این روش به سرعت در زمینه های مختلف مطالعه گیاهان مورد استفاده قرار گرفت. تکنیک (ISSR) یک روش وابسته به PCR است که شامل تکثیر بخشی از DNA می باشد که در یک فاصله قابل تکثیربین دو ناحیه تکرار ریزماهواره های مشابه قرار دارد که در جهت مخالف هم آرایش یافته اند.در این متد،SSR ها به عنوان آغازگر برای تکثیر نواحی بینSSR ها مورد استفاده قرار می گیرند. (تاوتزو رنز،۱۹۸۴). در این روش میکروساتلایت هایی با طول ۲۵-۱۶ نوکلئوتیدی بعنوان آغازگر استفاده می شوند.میکروساتلایت که بعنوان آغازگر استفاده می شوند می توانند دو، سه،چهار و پنج نوکلئوتیدی باشند.ISSR در مقایسه با آغازگر RAPD (۱۰نوکلئوتید) به دلیل استفاده از آغازگرهای بلند تر (۲۵-۱۶) از تکرار پذیری بالاتری برخوردار هستند. آغازگرهای بلند اجازه می دهند تا بتوان از دمای اتصال (۶۰-۴۵) بالاتری استفاده کرد. آغازگرهائی که در ISSRمورد استفاده قرار می گیرند می توانند در انتهای ′۳یا′ ۵ قلاب شوند.آغازگر غیر قلاب شده می تواند به هر جایی در ناحیه میکروستلایت روی DNAالگو متصل گرددو چون قلاب شده نیست ممکن است روی DNA الگو سر بخورد، در نتیجه باند های متعدد تولید نماید.آغازگر های قلاب شده در انتهای ′۳یا ′۵ فقط در ناحیه اختصاصی به DNA الگو متصل می شوند و باند های واضحی را تولید می نماید (گوپتا و همکاران ۱۹۹۴؛ میر و همکاران ،۱۹۹۳ و یو و همکاران ،۱۹۹۴).
مطالعاتی که بر روی تکرار پذیری آن انجام شده، نشان داده است که فقط ضعیف ترین باند ها هستند که قابل تولید مجدد نیستند حدود ۹۵-۹۲ درصد از بخش های نمره دهی شده وقتی که با بهره گرفتن از پلی آکریلامید شناسایی شدند می توانند در نمونه های DNA مشابه و در PCR های مجزا تکرار شوند (فانگ و رنر، ۱۹۹۷ و مورنو و همکاران ،۱۹۹۸).
نشانگرهای ISSR اکثراً به عنوان نشانگرهای غالب جدا می شوند که توارث مندلی ساده را دنبال می کنند (تسومارا،۱۹۹۶). این روش یک روش سریع، کارآمد، ساده، کم هزینه، قابلیت خود کار شدن و قابل تکرار است که اکثر فواید و مزایای ISSR و AFLP را برای عمومیت RAPD در بر دارد.این روش نیازی به استفاده از مواد رادیواکتیو خطرناک ندارد. آغازگرها نیز اختصاصی نبوده و می تواند براحتی طراحی و ساخته شوند (وانگ و همکاران ۱۹۹۸، یو و همکاران، ۱۹۹۴ و گوبتا و همکاران ۱۹۹۴). محصولات تکثیر شده نشانگرهای ISSR معمولاً بین ۲۰۰۰-۲۰۰ جفت باز طول دارند و توسط الکتروقورز با ژل پلی آکریلامید و آگارز قابل شناسایی می باشند.
از زمینه های کاربرد ISSRمی توان به انگشت نگاری ژنوم،نقشه یابی ژنوم، نشانمند کردن ژن و گزینش به کمک نشانگر، مطالعه تنوع ژنتیکی و فیلوژنتیکی اشاره نمود. در تخمین تنوع ژنتیکی در سطح درون گونه ای و میان گونه ای در تعداد زیادی از گونه های گیاهی مانند برنج، گندم، ارزن انگشتی، سیب زمینی و غیره از نشانگر ISSR استفاده شده است.فانگ و همکاران (۱۹۹۷) نشان دادند که آغازگرهای قلاب شده ISSR بسیار مفید و تکرارپذیرتر از آیزوزایم ها، RFLP و RAPD در تجزیه تنوع ژرم پلاسم نارنگی سه برگی هستند. از نشانگر های ISSR به عنوان وسیله ای در شناسایی ژنوتیپ ها و همچنین ساختار جمعیتی گونه های گیاهی ذرت (کانتی و همکاران ،۱۹۹۸) سیب زمینی (پروست و ویلکینسون،۱۹۹۹)، پرتقال سه برگی (فانگ و همکاران ،۱۹۹۷) و گندم نان (ناگااوکا و اوگی هارا،۱۹۹۷)استفاده شده است.
بلایر و همکاران (۱۹۹۹) در بررسی ۵۹ رقم برنج توسط مارکر ISSR و AFLP گزارش کردند که درصد پلی مورفیسم مشاهده شده توسط روش ISSRنسبت به AFLP بیشتر است. آغازگرهای دو نوکلئوتیدی نسبت به آغاز گرهای سه، چهار،پنج نوکلئوتیدی و سایر آغازگرهای تخصصی چند شکلی بیشتری نشان دادند.
فارسانی و همکاران (۱۳۸۶) تنوع ژنتیکی ۲۷ ژنوتیپ گیاه پنجه مرغی را توسط تعدادی صفات مورفولوژیک و نشانگر مولکولی ISSR مطالعه کردند.طبق گزارش آنها ژنوتیپ ها بر اساس ارتفاع گیاه به سه دسته مجزا تقسیم شدند. توسط چهار آغازگر ISSR در تشابه ۳۴ درصد در چهار گروه قرار گرفتند.
نان وهمکاران (۲۰۰۳) با مطالعه ۶۰ گیاه پامچال شامل چهار جمعیت طبیعی و یک جمعیت زراعی توسط نه آغازگر ISSR گزارش نمودند که تنوع موجود در بین گیاهان اهلی شده کمتر از جمعیت های طبیعی است. دلیل کاهش چشم گیر تنوع در جمعیت مزبور به خاطر فعالیت انسان در منطقه جمعیت اهلی شده می باشد.
روش های تجزیه و تحلیل داده های مولکولی برای مطالعه روابط تکاملی
در طول چند دهه اخیر تاکید زیادی بر تحلیل داده های سیستماتیک به شکل های مختلف شده است. نتیجه علاقه و بحث ممتد در این مورد منجر به ایجاد روش های فنتیک در مقابل کلادیستیک، برای ایجاد فرضیه های مختلف در مورد روابط میان گیاهان گردیده است.
روش های فنتیکی^[۲۸] به روش های تاکسونومی عددی نیز معروف هستند.در حقیقت روش های فنتیکی تشابه بین اعضاء را محاسبه و اعضا ی که تشابه بیشتری را دارند در یک گروه و اعضاء با تشابه کمتر در خوشه های جداگانه قرار می دهد (رحیمی نژاد،۱۳۸۵).
روش های کلادیستیک^[۲۹] که در سال ۱۹۶۷ معرفی شدند بر این فرض استوارند که اعضاء یک گروه، دارای تاریخچه تکاملی مشترک هستند. بنابراین اعضاء داخل یک گروه دارای ارتباطات خویشاوندی نزدیک تر نسبت به اعضاء غیر هم گروه هستند.این روش نیز به داده های زیادی نیاز داشته اما برعکس روش فنتیک امتیاز یکسان به خصوصیات مورد نظر برای طبقه بندی نمی دهد، به خاطر این که بعضی از خصوصیات روابط تکاملی را خیلی بهتر نسبت به خصوصیات دیگر نشان می دهند. امروزه اکثر زیست شناسان تکامل روش کلادیستیک را به فنتیک ترجیح می دهند. لذا درخت فیلوژنتیک در بعضی موارد درخت کلادیستیک نامیده می شود.مشکلات فراوان در مسیر بدست آوردن اطلاعات از خصوصیات مورفولوژیکی مهمترین عاملی است که زیست شناسان را ترغیب به استفاده از اطلاعات مولکولی در بررسی های فیلوژنتیکی می کند. در حقیقت اطلاعات مولکولی سه مزیت عمده نسبت به سایر اطلاعات دارند :
الف – با یک آزمایش می توان با سرعت اطلاعات فراوانی به دست آورد .
ب- خصوصیات مولکولی گمراه کننده نیستند . نوکلئوتید های C، G،A،T به آسانی قابل تشخیص هستند و با یکدیگر اشتباه گرفته نمی شوند .
ج – داده های مولکولی به آسانی قابل تبدیل به شکل های عددی هستند و از این رو می توان روی آنها تجزیه های آماری انجام داد (نقوی و همکاران ،۱۳۸۸).
برای ترسیم در خت فیلوژنتیک بر اساس داده های همردیفی، می توان از روش های مبتنی بر فاصله (فنتیکی) یا روش های مبتنی بر کاراکتر (کلادیستیک ) استفاده کرد. روش های مبتنی برفاصله فاصله های جفتی (دو به دو ) را با توجه به برخی اندازه گیری ها محاسبه می کنند و تنها با فاصله های تثبیت شده درخت را رسم می کنند. در حالیکه در روش های مبتنی بر کاراکتر درختی را ترسیم می کنند که توضیع الگوی داده های واقعی را برای هر کاراکتر بهینه کنند. فاصله های دوتایی در این روش تثبیت نشده و آنها را به وسیله توپولوژی درخت تعیین می کنند. از معروف ترین روش های مبتنی بر فاصله UPGMA^[30] ، اتصال همسایه^[۳۱] و حداقل تکامل^[۳۲] هستند همچنین مهمترین روش های مبتنی بر کاراکتر شامل حداکثر امساکی^[۳۳] و حداکثر درستنمایی^[۳۴] هستند(نقوی و همکاران، ۱۳۸۸).
روش اتصال همسایه در بین روش های مبتنی بر فاصله از پرکاربرد ترینروش های ساخت درخت فیلوژنتیکی است.معمول ترین روش برای بررسی نیاکانروش امساکی است. روش امساکی مورد قبول ترین رابطه رانه تنها بر اساس داده های مولکولی بلکه بر اساس هر نوع داده ای ارائه می دهد. به ساده ترین بیان روش امساکی فیلوگرام های فیلوژنی را بر اساس این پیش فرض بنیان می گذارد، که صفات مشاهده شده در نتیجه کمترین تغییرات تکاملی شکل گرفته اند. در این روش رجعت حالات صفات پذیرفته شده است و فیلوگرافی که کمترین مجموع تغییرات را نیاز دارد فیلوگرافی با حداکثر امساک خواهد بود . (رحیمی نژاد،۱۳۸۵).
روش حداکثر درست نمایی فیلوگرافی را انتخاب می کند که احتمال وقوع داده های مشاهده شده را به حداکثر برساند. این بدان معنی است که با در اختیار داشتن داده ها و مدلی در مورد تکامل شخص با در نظر گرفتن داده ها از یک فیلوگرام معین مقدار احتمال را محاسبه می نماید . (رحیمی نژاد،۱۳۸۵).
ارزیابی درخت فیلوژنتیکی
آزمونهای متفاوتی برای ارزیابی درخت ترسیم شده وجود دارد.یکی از معروف ترین روش ها در این خصوص روش بوت استرپ است که برای اطمینان نقاط شاخه های مختلف داخل یک درخت به کار می رود. این روش در سال ۱۹۷۹ به عنوان روش ارزیابی درخت ها در تجزیه های فیلوژنی به وسیله فلسنستین معرفی شد. بوت استرپ در حقیقت آزمون آماری درخت های فیلوژنتیکی با بهره گرفتن از روش نمونه برداری های متعدد از داده های اولیه است و برای آزمون درخت های ترسیم شده با روش های فاصله ای و حداکثر درست نمایی به کار گرفته می شود. نتایج حاصل از این آزمون به صورت عددی در کنار گره یک درخت نشان داده می شود که در واقع درصد دفعاتی است که هر شاخه مشخص در نمونه برداری های مختلف توسط این آزمون و درخت حاصل از تشکیل آن شرکت می کند. گروههایی که بوت استرپ آنها بیش از ۵۰ باشد به عنوان گروههایی مورد تایید این روش مد نظر قرار می گیرد (فلسنستین ،۱۹۸۸).
عموماً درخت فیلوژنتیکی و فیلوگرام های تکامل با بهره گرفتن از یک برون گروه یا گروه خویشاوند با گروه مورد مطالعه مقایسه می شوند وقتی یک برون گروه انتخاب شد اعضای گروه تحت بررسی را به عنوان اعضای درون گروه می پذیریم که در مقایسه با برون گروه بسیار به هم نزدیک تر هستند. به عبارت دیگر اعضای درون گروه بعد از تنوع در برون گروه از آن جدا شده اند.اغلب چندین برون گروه در ترسیم درخت استفاده می شود (سعیدی ،۱۳۸۲).
هتروزیس و عوامل موثر در بروز آن
هتروزیس یا رشد عالی هیبرید عبارت است از به وجود آمدن هتروزیگوسیتی همراه با رشد سریع،افزایش رشدو عملکرد،مقاومت به بیماریها،آفت ها و یا شرایط نامساعد محیطی. در گیاهان هیبرید ممکن است از تلاقی بین لاین های اینبرد،واریته یا واریته های همسانه ای (کلونیال)تولید شود.هیبرید بین دولاین در اصلاح نباتات اهمیت فراوان دارد.هیبرید مطلوب باید از بهترین واریته های دگر گشن برتر باشد.مقدار هتروزیس رااز مقایسه میانگین نتاج هیبرید با میانگین والدین یا با میانگین والد برتر اندازه گیری می کنند. پدیده هتروزیس در بیشتر گیاهان دگر گشن و خود گشن که مورد آزمایش قرار گرفته اند مشاهده شده است . کلمه هتروزیس یک کلمه یونانی است که از دو کلمHeter به معنی اختلاف و Osis به معنی حالت گرفته شده است.هتروزیس دقیقاً عکس پدیده پسروی یا انحطاط ناشی از خویش آمیزی است که غالباً در گیاهان دگر بارور مشاهده می شود (اهدایی،۱۳۸۲).
افرادی از قبیل مندل که با دورگ گیری گیاهان سر وکار داشتند نیز به پدیده هتروزیس توجه کرده بودندمندل دلایل و عوامل خیلی زیادی برای پدیده هتروزیس ارائه شده است که از مهمترین آنها می توان به تئوری فوق غالبیت ،غلبه واثرات متقابل ژنی هتروزیس اشاره کرد(فارسی و باقری،۱۳۸۸).
فوق غالبیت
اولین نظریه هتروزیس توسط شول و ایست پیشنهاد شد.به عقیده شول عمل هیبریداسیون که عبارتست از ترکیب عناصر غیر متشابه با ایجاد حالت هتروزیگوسیتی سبب تحریک فعالیت های فیزیولوژیکی موجود می شودو این فعالیت ها در اثر خویش آمیزی متوالی به نسبت افزایش هموزیگوسیتی در نتاج کاهش می یابد (فارسی و باقری،۱۳۸۸).به همین دلیل شول اصطلاح« هتروزیس» رو به کار برد. اگر چه تشخیص داده شده است که پدیده هتروزیس در اثر کنش ها و واکنش های فیزیولوژیکی موجود ایجاد می شود ،ولی این نظریه کاملاً بر اساس قوانین مندل تعریف نشده بود و فقط برتری هتروزیگوت را به هر دو هموزیگوت غالب و مغلوب بیان می کرد. این نظریه مفهوم کاملاً تازه ای بر پایه اثرهای متقابل آلل ها در یک لوکوس بود و با مفهوم ساده غلبه که شامل دو آلل است و مورد قبول همه واقع شده بود کاملا مغایرت داشت. در این فرضیه اگر هتروزیس در یک مکان ژنی را در نظر بگیریم موضوع کاملاًصدق می کندیعنی برای صفات کیفی صادق است.اشکال از اینجا ناشی می شود که آنچه که برای ژنهای صفات کیفی صدق می کند ممکن است برای ژنهای صفات کمی صدق نکندیعنی هتروزیس در صفاتی چون عملکرد تابع هتروزیس در یک مکان ژنی نیست و ژنهای غالب بعضی مکانها گاهی اوقات باعث کاهش محصول می شوند.