- تیغ جراحی
- وسایل تشریح (قیچی،پنس،اسکالپل،تشتک تشریح)
- جالوله ای
- دستگاه میکروتوم
- ترازو
- جار شیشه ای مخصوص بیهوش کردن موش
- میکروسکوپ
- دستگاه عصاره گیر
- فیدر( سرنگ مخصوص خوراندن دارو)
- دستگاه اتوتکنیکون
- دستگاه حمام آب گرم
- ظروف مخصوص رنگ آمیزی
- قالب های مخصوص قالب گیری
- دستگاه آون
۲-۲- حیوانات مورد استفاده و نحوه نگهداری آنها
حیوانات مورد استفاده در این تحقیق ۴۰ سر موش صحرایی نر بالغ نژاد ویستار در محدوده سنی ۵/۲ تا ۳ ماه و وزن تقریبی۲۰۰ تا ۲۳۰ گرم بوده است که از بیمارستان نمازی شیراز تهیه و در همان محل نگهداری شدند. درجه حرارت محیط ۲ ± ۲۳ در طول شبانه روز ثابت ، دوره نوری ۱۲ ساعت روشنایی و ۱۲ ساعت تاریکی بوده است.
آب و غذای فشرده مخصوص در تمام طول دوره تحقیق بدون محدودیت در اختیار موش ها قرار داده شده است. موش ها در قفس هایی از جنس پلی کربنات با اندازه ۴۰×۲۵×۱۵ و با سقف مشبک که از جنس استیل است نگهداری شدند، به طوری که در هر قفس تعداد ۸ سر موش نگهداری می شد. در کف قفس ها مقداری خاک اره ریخته می شد و کف قفس ها هر سه روز تعویض و قفس ها هفته ای یکبار ضد عفونی می شد. )شکل۲-۱)
شکل(۲-۱) جایگاه نگهداری حیوانات
۲-۳- گروه بندی حیوانات
تعداد کل موش های مورد استفاده در این تحقیق ۴۰ سر بوده که در ابتدا این موش ها وزن کشی شده و بر اساس محدوده وزنی در ۵ گروه جداگانه قرار داده شدند.(شکل۲-۲)
شکل(۲-۲)روش وزن کشی حیوانات مورد آزمایش
موش ها به صورت زیر تقسیم بندی شدند:
۱-گروه کنترل: حیوانات این گروه در شرایط متعادل آزمایشگاهی ۱۲ ساعت روشنایی و ۱۲ ساعت تاریکی نگهداری شدند و در حین آزمایش به جز آب و غذای استاندارد هیچ ماده یا دارویی را دریافت نکردند.
۲-گروه شاهد: به این حیوانات روزانه ۲/۰ میلی لیتر DMSO به عنوان حلال به صورت خوراکی تجویز می شد.
۳- گروه تجربی (۱) با حداقل دوز عصاره: به حیوانات این گروه به عنوان گروه تیمار حداقل روزانه مقدار mg/kg/day ۵۰ عصاره برگ گیاه ترخون بصورت خوراکی دریافت نمودند.
۴- گروه تجربی (۲) با دوز متوسط عصاره: این حیوانات به عنوان گروه تیمار متوسط روزانه مقدار mg/kg/day ۱۰۰عصاره برگ گیاه ترخون بصورت خوراکی دریافت نمودند.
۵ - گروه تجربی (۳) با دوز حداکثر عصاره: این حیوانات به عنوان گروه تیمار حداکثر روزانه مقدار mg/kg/day ۲۰۰عصاره برگ گیاه ترخون بصورت خوراکی دریافت نمودند.(۳)
۲-۴- روش تهیه و تجویز عصاره
۲-۴-۱- روش تهیه عصاره برگ گیاه ترخون
ابتدا مقداری برگ گیاه ترخون(حدود ۵ کیلوگرم) را پس از پاک کردن ،در سایه خشک کرده و آن را توسط آسیاب برقی پودر کردیم و سپس به میزان برابر ۵۰% آب و ۵۰% الکل طبی ۹۶%را به آن اضافه نمودیم، به طوری که مخلوط آب و الکل روی سطح پودر را بپوشاند. سپس مدت ۷۲ ساعت صبر کردیم تا آب و الکل اثرات خود را بگذارند. روی ظرف محتوی مخلوط را با ورق آلومینیومی پوشاندیم تا الکل بخار نشود. همچنین طی این مدت به طور متناوب ظرف تکان داده می شد تا عصاره در حلال خوب حل شود.بعد از گذشت این زمان مخلوط را صاف نمودیم. محلول صاف کرده را توسط دستگاه سانتریفوژ با دور ۴۵۰۰ دور در دقیقه به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفوژ نموده و مایع حاصل در ظرفی روباز قرار داده شد تا حلال بخار شود. سرانجام پس از گذشت چند روز عصاره تغلیظ شده و به رنگ سبز پر رنگ به دست آمد که این عصاره غلیظ را روی یک ورق آلومینیومی که کناره های آن به طرف بالا تا شده ، ریخته و درون فور قرار می دهیم. دمای فور را در ۴۰ درجه سانتی گراد تنظیم نمودیم تا عصاره کاملاً خشک شود و یک ماده خشک بر جای بماند.(۶۳)
۲-۴- ۲- روش تجویز دارو
در این مرحله عصاره گیاه را در DMSO^[26] حل کرده و غلظت های مناسب تهیه شد. انتخاب غلظت های مناسب با توجه به سمیت خوراکی عصاره برگ گیاه ترخون در موش صحرایی،صورت پذیرفت.(۶۴)
DMSO یا دی سولفوکساید یک حلال آپروتیک قطبی است که دارای پیوند دوگانه گوگرد-اکسیژن می باشد. ویژگی خاص این ترکیب در حل کردن بسیاری از ترکیبات قطبی و غیر قطبی و قابلیت اختلاط پذیری آن با آب و مایعات فیزیولوژیک است.(۱۲۰)
برای خوراندن عصاره به حیوانات از نیدل مخصوص که به صورت پلاستیک با انتهای گرد یا ساده به فرم انحنا دار می باشد استفاده شد. حجم معینی از عصاره با مقادیر(mg/kg) 50،۱۰۰،۲۰۰ را بر داشته و حیوان را از پوست ناحیه پشت گردن طوری نگه می داریم که حرکات آن به حداقل برسد.سپس پوست ناحیه سر را کمی به عقب کشیده تا دهان باز شود و راه مری کاملاً باز بماند. سپس عصاره به کمک سرنگ مجهز به نیدل گاواژ وارد دهان حیوان می شود. نیدل باید به آسانی وارد مری گردد و دقت شود تا عصاره کاملاً بلعیده شود و از دهان خارج نگردد. از همین روش برای تجویز آب مقطر به گروه شاهد استفاده می شود. در این تحقیق مدت زمان خوراندن آب مقطر و عصاره آبی الکلی برگ گیاه ترخون ۳۰ روز در نظر گرفته شد که به صورت روزانه بین ساعات ۹-۸ صبح صورت گرفت.

تجویز دارو به صورت دهانی در ساعت معین و ثابتی از روز انجام گردید.از تمام حیوانات در پایان ۳۰ روز به وسیله بیهوشی خفیف (اتر) خونگیری از ناحیه بطن انجام شد و سپس تیروئید ها را از بدن جهت تهیه مقاطع بافتی خارج کردیم. (شکل۲-۳)
به منظور بررسی تاثیر احتمالی عصاره برگ ترخون بر وزن حیوانات مورد آزمایش قبل از تزریق عصاره و بعد از پایان دوره آزمایش همه نمونه ها توزین شده و مشخصات وزنی آنها یادداشت گردید.
شکل(۲-۳)روش تجویز دارو
۲-۵-روش بیهوش کردن حیوانات وخون گیری
۲-۵-۱- بیهوش کردن حیوانات
یک شبانه روز پس از آخرین تجویز عصاره، حیوانات را درون ظرف مخصوص بیهوشی (جار) قرار داده به کمک پنبه آغشته به اتر و به روش استنشاقی بیهوش کرده، بدین صورت که حیوانات مورد نظر را یکی یکی در حدود یک تا دو دقیقه در آن قرار داده و زمانیکه علائم بیهوشی خفیف در حیوان مشاهده گردید، حیوان را از محفظه مخصوص خارج ساخته و روی میز تشریح قرار داده شد. در این هنگام تعداد ضربان قلب و تنفس موش های صحرایی در هر دقیقه کاهش محسوسی می یابد و از این طریق می توان از بیهوشی کامل حیوان اطمینان حاصل کرد. دلیل انتخاب اتر برای بیهوشی این است که بیهوشی با اتر خفیف است و تاثیر کمتری بر سرعت جریان خون دارد و این نکته در عمل خون گیری اهمیت فراوانی دارد.
۲-۵-۲- خون گیری
پس از بیهوشی حیوان را به پشت روی دستگاه مخصوص تشریح ثابت کرده ،در ابتدا با انگشت قفسه سینه حیوان را لمس می کنیم تا محل بیشترین ضربان قلب را بیابیم، سوزن انسولین را در ناحیه ای که قله ضربات است وارد می کنیم، تپش قلب را در سرنگ به صورت لرزش واضحی حس خواهیم کرد. در این زمان می توانیم خونگیری را کامل کنیم، سپس بلافاصله این خون به درون لوله آزمایش (فاقد هر گونه مواد انعقادی) جهت تهیه سرم ریخته شد.(شکل۲-۴)
شکل(۲-۴) روش خونگیری از موش
۲-۶- روش تهیه سرم و نگهداری آن
پس از خون گیری، نمونه های لخته شده با دورRPM ^[۲۷]۲۵۰۰ و به مدت ۱۵ دقیقه سانتریفوژ گردید.سرم حاصل با بهره گرفتن از پیپت پاستور جدا و درون لوله های یک بار مصرف آزمایشگاهی ریخته و پس از زدن بر چسب روی هر لوله و نوشتن مشخصات لازم درب آن را به وسیله پارافیلم بسته و تا زمان سنجش هورمون ها در دمای ۲۰- درجه سانتی گراد نگهداری شدند.
۲-۷- روش خارج کردن تیروئید و تهیه و آماده سازی مقاطع بافتی
بعد از انجام عمل خون گیری به وسیله قیچی و پنس در ناحیه شکم برش افقی داده و بعد از جدا کردن بافت تیروئید و خارج کردن آن به طور کامل با سرم فیزیولوژی شسته شد. سپس آنها در داخل شیشه های محتوی محلول فیکساتور فرمالین ۱۰% قرار گرفت.
۲-۸- آماده سازی نمونه های بافتی تیروئید جهت مطالعات میکروسکوپی
۲-۸-۱- مرحله تثبیت^[۲۸]
برای فیکس کردن نمونه ها از محلول فرمالین ۱۰% به مدت ۲۴ ساعت استفاده شد.
۲-۸-۲- مرحله آبگیری^[۲۹]