۳-۶٫ آزمایشات حساسیت داروئی در مایکوباکتریوم­ها
بر طبق استاندارد­های CDC بر روی کشت­های LJ حاوی کلونی­هایM. tuberculosis تست حساسیت دارویی نسبت به آنتی­بیوتیک ریفامپین µg/ml40، ایزونیازید µg/ml2/0، استرپتومایسین ۱۰µg/ml، اتامبوتول µg/ml2، کاناماسین µg/ml20 و اتیونامید µg/ml20 به روش تناسبی (proportional) انجام ­گرفت . (Farnia P. et al., 2004)
سوسپانسیونی از باکتری مطابق ۱ مک فارلند مورد مطالعه بر روی محیط کشت LJ که داروهای مورد نیاز با غلظت­های معین به آن افزوده شده بود تلقیح داده ­شد و نتایج آزمایش ۲۸ روز بعد از تلقیح قرائت گردید. تعداد کلونی­ها در سطح محیط حاوی دارو، تعداد باسیل­های مقاوم به آن را مشخص کرد. نسبت تعداد باسیل­ها مقاوم به هر دارو به تعداد باسیل­های زنده در ماده تلقیح شده اگر از حدی که نسبت بحرانی برای مقاومت نامیده می­ شود کمتر باشد، باسیل نسبت به آن دارو حساس و اگر معادل آن حد یا بیشتر باشد سویه مقاوم تلقی می­ شود.
۳-۶۱٫ تهیه محلول استاندارد مک فارلند
استاندارد مک فارلند تعدا باکتری­ ها در ۱cc سوسپانسیون را نشان می­دهد. یک مک فارلند ۳×۱۰۸ باکتری دارد. از خصوصیات مهم استاندارد مک فارلند این است که در هر آزمایشگاه بدون در اختیار داشتن وسیله خاصی و فقط با بهره گرفتن از مک فارلند می­توان مقدار باکتری را ارزیابی کرد. برای تهیه این محلول ۹۹۰ ml اسید سولفوریک ۱% به ۱۰ ml کلرید باریم ۱% اضافه ­گردید. ۶-۴ میلی­لیتر از محلول استاندارد تهیه شده در لوله­های در پیچ دار هم اندازه ریخته و درب لوله­ها محکم بسته شد و در تاریکی و در دمای اتاق نگه­داری ­گردید.
۳-۶-۲٫ تهیه سوسپانسیون باکتری
ابتدا ۱۰-۸ کلونی از باکتری­ ها برداشته ­شد و به شیشه­های کوچک در پیچ دار حاوی ۲ میلی لیتر سرم فیزیولوژی یا آب مقطر استریل اضافه ­گردید. ۱۰-۸ عدد گویچه شیشه ­ای (pearls) به ظرف­ها اضافه ­شد و به مدت ۵-۴ دقیقه با بهره گرفتن از شیکر، سوسپانسیون­ها یکنواخت ­گشتند. سپس به کمک سمپلر از روی سوسپانسیون­ها برداشته و به لوله حاوی ۱cc آب مقطر تا حدی اضافه گردید تا کدورت آن به یک مک فارلند ­رسید. از سوسپانسیون حاضر رقت­های،و تهیه ­گردید. ۲۰۰µlit به هر یک از محیط­های حاوی آنتی بیوتیک­ها و محیط شاهد فاقد آنتی­بیوتیک اضافه گردید. پس از افزودن سوسپانسیون لوله­ها به آرامی تکان داده شد بطوریکه سوسپانسیون با تمام محیط تماس داشته پیدا ­کرد.

3-7. کشت سویه­های انتخابی در محیط میدل بروک ۷H9
این محیط یکی از محیط­های مایع و اختصاصی برای رشد خالص جهت کشت مایکوباکتریوم­ها بخصوص باکتریM. tuberculosis می­باشد.
۳-۷-۱٫ مواد مورد نیاز

• پودر محیط ۷H9، گلیسرین و یا پلی سوربات۸۰ و ADC[70] (آدنوزین دئوکسی کاتالاز)

۳-۷-۱-۱٫ آماده ­سازی محیط

• ۳۵/۲ گرم از پودر محیط ۷H9 در ۴۵۰ میلی­لیتر آب مقطر حل ­گردید.
• ۲ میلی­لیتر گلیسرین به آن اضافه ­شد (یا به جای آن از polysorbate 80 ) و به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد اتوکلاو گردید.
• پس از سرد شدن تا دمای ۴۵ درجه سانتی ­گراد، با یک ویال (۵۰۰ میلی­لیتر) از محیط غنی شده میدل بروک ADC (آدنوزین دئوکسی کربونات) به خوبی مخلوط ­گردید.
• برای بررسی آلودگی محیط به مدت یک روز در انکوباتور قرار ­گرفت، سپس در یخچال نگهداری شد .(Middlebrool and Cohn., 1958)

پودر محیط ۷H9 حاوی مواد و مقادیر زیر برای ۹۰۰ میلی­لیتر از آب مقطر، به قرار زیر است:

• آمونیوم سولفات ۵/۰ گرم
• ال-گلوتامیک اسید ۵/۰ گرم
• سیترات سدیم ۱ /۰ گرم
• پیرودوکسین ۱ گرم
• بیوتین ۵/۰ گرم
• دی سدیوم فسفات ۵/۲ گرم
• فسفات پتاسیم ۱ گرم
• سیترات آمونیوم ۰۴/۰ گرم
• سولفات منیزیم ۰۵/۰ گرم
• کلرید کلسیم ۵/۰ گرم
• سولفات روی ۱ گرم
• سولفات مس ۱ گرم

ADC حاوی مواد و مقادیر زیر برای ۱ لیتر می­باشد:

• کلرید سدیم ۵/۸ گرم
• دکستروز ۲۰ گرم
• کاتالاز ۰۳/۰ گرم
• آلبومین بووین ۵۰ گرم

۳-۷-۱-۲٫ انتحاب سویه­ها و کشت
برای کشت در این محیط، سویه­های رشد یافته در محیط LJ بنحوی انتخاب شدند کهM. tuberculosis حساس دارای تست­های نیاسین و TCH، فعالیت کاتالازی ۲۲و ۶۸ درجه مثبت و حساس به تمامی آنتی­بیوتیک­ها بوده ­اند و سویه­هایی M. bovis دارای تست نیاسین منفی، فعالیت کاتالازی ۲۲ درجه مثبت، فعالیت کاتالازی ۶۸ درجه منفی، TCH حساس و حساس به تمامی آنتی بیوتیک­ها بوده ­اند.

• برای هر سویه ۵۰ میلی­لیتر از محیط ۷H9 را در ارلن ریخته و مقدار اندکی از کلونی­های کشت LJ به محیط مایع اضافه ­گردید.
• کشت­ها به مدت ۲ هفته در انکوباتور شیکردار قرار گرفت.
• بعد از آن ۵۰ میلی­لیتر دیگر از محیط ۷H9 به آنها اضافه کرده و دوباره به مدت ۴ هفته در انکوباتور شیکردار قرار گرفت.

۳-۸٫ جمع­آوری سویه­ها میکروبی، استخراج و خالص­سازی پروتئین
به منظور تائید رشد کشت­ها، از روش رنگ­آمیزی ذیل-نلسون استفاده ­گردید و کشت­ها یک ساعت با rpm 3000 و دمای ۳ درجه سانتی ­گراد سانتریفیوژ ­شد، سپس محلول رویی را به منظور بررسی پروتئین­های ترشحی و رسوب حاصله که حاوی کلنی­های باکتری بوده مورد ارزیابی قرار ­گرفت.
۳-۸-۱٫ استخراج پروتئین­های غشایی
۳-۸-۱-۱٫ مواد مورد نیازstrong>