تحقیقات انجام شده در مورد : بررسی ارتباط چند شکلی های ژنتیکی CAT C-262T و NQO1 C609T با ... |
استخراج DNA از خون کامل به روش جوشاندن (Boiling) انجام شد که جزئیات روش کار طبق موارد گفته شده در منبع مورد نظر میباشد (Newton CR et al, 1995).
۳-۴ استخراج DNA از بافی کت با کیت DNP
۱- ۵ میکرولیتر پروتئاز را روی ۱۰۰ میکرولیتر از نمونه بافی کت ریخته و آن را به مدت ۱۰ ثانیه ورتکس میکنیم سپس لوله ها را به مدت ۱۰ دقیقه درون Hot plate در دمای۷۲ درجه سانتیگراد قرار میدهیم.
۲- بعد از بیرون آوردن لوله ها از Hot plate در دمای۷۲ درجه، ۴۰۰ میکرولیترLysis Solution ریخته و به مدت ۲۰- ۱۵ ثانیه ورتکس میکنیم تا یک سوسپانسیون کاملا هموژن بدست آید.
۳- به محلول فوق ۳۰۰ میکرولیتر از Precepitation Solution اضافه کرده و برای ۵ ثانیه ورتکس میکنیم، سپس لوله ها درون سانترفیوژ با دور g 12000به مدت ۱۰ دقیقه قرار میدهیم.
۴- بعد از بیرون آوردن از سانترفیوژ محلول رویی لوله ها را خالی کرده و لوله ها را روی یک دستمال به مدت ۳-۲ ثانیه قرار میدهیم.
۵- لوله ها را برگردانده و به هر کدام ۱ میلی لیتر از Wash Buffer اضافه کرده و به مدت ۵-۳ ثانیه ورتکس کرده و مجددأ درون سانترفیوژ با دورg 12000 این بار به مدت ۵ دقیقه قرار میدهیم.
۶- بعد از اتمام زمان سانترفیوژ مایع رویی را خالی کرده و رسوب ته لوله را نگه داشته و برای اینکه Wash Buffer درون لوله ها کاملا خشک شود آن ها را به مدت ۵ دقیقه درون Hot plate 65 درجه قرار میدهیم.
۷- بعد از خشک شدن لوله ها آن ها را بیرون آورده و ۳۰ میکرولیتر از Solvent Buffer اضافه کرده لوله ها را به آرامی تکان میدهیم و مجددأ درون Hot plate 65 درجه قرار میدهیم به مدت ۵ دقیقه تا رسوب ته لوله که همان DNA است به خوبی حل شود. DNA بدست آمده را در دمای ۲۰- درجه سانتیگراد نگهداری می کنیم.
۳-۵ PCR
از واکنش زنجیرهای پلیمراز جهت تعیین ژنوتیپهای چندشکلی ژنتیکی ژنهایCAT C-262T و NQO1 C609T استفاده کردیم. برای انجام این کار مواد مورد نیازی که در بالا ذکر شد را از فریزر ۲۰- درجه سانتیگراد بیرون میآوریم. بعد از آب شدن مواد در دمای اتاق جهت درست کردن میکس آنزیم آنها را روی یخ قرار می دهیم. جهت تهیه ۲۰ میکرولیتر مخلوط واکنش به ازای هرلوله، مواد مورد نیاز را طبق جدول ۳-۲ با هم مخلوط میکنیم.
جدول ۳-۲: مواد مورد نیاز جهت تهیه مخلوط واکنش PCR
اجزای واکنش | حجم مورد نیاز به ازای هر واکنش (μl) |
۱۰x PCR buffer | ۵/۲ |
dNTP (10 mM) | ۵/۰ |
MgCl2 (50 mM) | ۷۵/۰ |
۱۰) پرایمر رفتμM( | ۱ |
۱۰)پرایمر برگشتμM( | ۱ |
Taq DNA polymerase | ۳/۰ |
آب استریل | ۹۵/۱۳ |
فرم در حال بارگذاری ...
[جمعه 1400-07-23] [ 03:09:00 ق.ظ ]
|