• مرحله­ بعد، فاز جداسازی است که طی آن 200 میکرو­لیتر کلروفرم اضافه کرده و به مدت 15 ثانیه با دست تکان می­دهیم، سپسویال به مدت 5 دقیقه در دمای آزمایشگاه قرار داده شد.

• در ادامه، نمونه در دمای 4 درجه ی سانتیگراد، در دورg12000و به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد. سانتريفيوژ سبب تشکیل سه فاز می­ شود: فاز رویی که فاز آبی بوده و حاوی اسیدنوکلئیک می­باشد، فاز میانی که فاز پروتئینی بوده و فاز پایینی که شامل کلروفرم و ترایزول بوده است.

• مرحله­ بعد تشکیل شدن رسوب RNA است که طی آن به آرامی فاز آبی محتوی RNA، برداشته شده و به یک ویال دیگر منتقل شد و هم حجم مقدار انتقال یافته، الکل ایزوپروپانول اضافه شد.

• ویال به مدت 10 دقیقه در دمای آزمایشگاه قرار داده شد تا عمل رسوب گذاری به خوبی انجام شود. پس از آن، ویال به مدت 10 دقیقه در دور g12000، در دمای 4 درجه­ سانتیگراد سانتریفیوژ شد.

• پس از سانتریفیوژ، دو فاز تشکیل شد: محلول سوپرناتانت و رسوب RNA. محلول سوپرناتانت بالایی که حاوی ایزوپروپانول بود از سطح رسوب RNA کشيده شد. ویال حاوی رسوب RNA به مدت 10 دقیقه در دمای آزمایشگاه قرار داده شد تا خشک شود.

• در انتها 20 تا 50 میکرولیتر آب فاقد نوکلئاز^[59] به رسوب انتهایی ویال اضافه شد و رسوب در آب حل شد.

3-8-2- بررسی کیفی RNAهای استخراج شده به وسیله الکتروفورز روي ژل آگارز
نانودراپ دستگاهی است که شدت نور را بصورت تابعی از طول موج اندازه گیری می­ کند. در حقیقت این دستگاه با بهره گرفتن از میزان جذب نور، تعیین غلظت می­ کند. برای بررسی خلوص RNA­های استخراج شده، می­توان از نسبت جذب نوری در طول موج­های 260 و 280 نانومتر (A₂₆₀/A₂₈₀) استفاده کرد. این نسبت باید در بهترین حالت بین 8/1 تا 2 باشد و نسبت­های کمتر نشان دهنده آلودگی به پروتئین می­باشد.

روش کار:
ابتدا با 1 میکرولیتر آب مقطر دستگاه کالیبره شد. سپس 1 میکرولیتر RNAی استخراج شده روی لنز دستگاه قرارداده و جذب آن در طول موج 260 نانومتر خوانده شد. عدد خوانده شده توسط دستگاه، نشان دهنده غلظت RNA در یک میکرولیتر می­باشد. با بهره گرفتن از این غلظت مقدار RNAای که برای سنتز cDNA باید مورد استفاده قرار گیرد، محاسبه شد. براساس غلظت خوانده شده، به ‌منظور بررسي صحت استخراج RNA، از الکتروفورز 5/0 ميکروگرم RNA مورد نظر بر روي ژل آگارز 2/1% استفاده شد. براي اين منظور ابتدا 2/1 گرم پودر آگارز را در 100 ميلي­ليتر بافر TAE با بهره گرفتن از حرارت حل نموده و پس از يکنواخت و همگن شدن، محلول را در ظرف مخصوص و با قرار دادن شانه در آن، ريخته و پس از بستن ژل، به آرامي شانه را از داخل ژل خارج کرده و ژل را درون تانکي که حاوي بافر TAE است قرار داده شد. سپس RNA استخراج شده با مقدار مناسبي از رنگ بارگذاري^[60] مخلوط شد و در چاهک ژل آگارز 2/1% در بافر TAE تخليه شد و در ولتاژ 90 به مدت 40 دقيقه الکتروفورز گرديد. پس از آن، ژل به مدت 10 دقيقه در ظرف حاوي اتيديوم برومايد يک درصد رنگ­آميزي و سپس با آب مقطر شستشو داده شد و در زير نور ماوراءبنفش عکسبرداري انجام گرديد و روی ژل دو باند مشاهده شد که نشان دهنده صحتRNA­های استخراج شده بودند.
3-8-3- تیمار کردن نمونه­های RNAی استخراج شده
تیمارکردن نمونه های RNAی استخراج شده با DNase I صورت می پذیرد که این کار جهت حذف آلودگی ژنومی به کار می­رود. مقادیر بین 5/0تا 5 میکروگرم از RNA را می­توان تیمار کرد، ولی مقدار بهینه­ آن 1 میکروگرم است.
روش کار:
میزان 1 میکروگرم از محلول RNA(بر اساس جذب خوانده شده توسط نانودراپ) برداشته شده و به یک ویال منتقل شد، سپس با مواد ذکر شده در جدول زیر ترکیب می­ شود.
جدول(3-4): مواد مورد استفاده در تیمار نمونه­هایRNA

نام ماده
مقدار

RNA
1µg

DNase I
1µl

RNase inhibitor (20 u/µl)
1µl

DNase I buffer
2µl

سپس جمع موارد فوق از عدد 20 کم شد تا مقدار آب فاقد نوکلئاز که می­بایست به این مواد اضافه می­شد، به دست آید. پس از اضافه کردن مواد با یکدیگر، ویال به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه­ سانتیگراد در دستگاه ترمومیکسر قرار داده شد تا عمل انکوباسیون انجام گیرد. پس از این زمان، 2 میکرولیتر محلولEDTA^[61](25mM)، به ویال مذکور اضافه شد.EDTA یک کلات کننده­ فعالیت DNase I است و سبب متوقف کردن فعالیت این آنزیم می­ شود.پس از تیمارکردن، مجددا جذب RNA با نانودراپ خوانده شد. با کسب اطمینان از مناسب بودن غلظت RNA، از آن برای سنتز cDNA استفاده شد.
3-8-4- سنتز­DNA مکمل (cDNA) از روی الگوی RNA
با بهره گرفتن از فرایند نسخه برداری معکوس، رشته DNA از روی الگوی RNA ساخته می­ شود. محصول بدست آمده DNA­ی مکمل یاcDNA^[62] نام دارد. در واقع واکنش رونوشت برداری معکوس، واکنشی است که طی آن، آنزیم^[63]نسخه بردار معکوس، RNA را به cDNA تبدیل می­ کند.
از مقادیر 5/0 تا 2 میکروگرم می­توان برای سنتز cDNA استفاده کرد، ولی مقدار بهینه­ RNA برای سنتز cDNA از روی آن، 1میکروگرم است.
روش کار:
1- 1 میکروگرم از RNA­ی تیمار شده با IDNase برداشته شده و به داخل یک ویال 5/1 میلی لیتری ریخته شد. سپس 1میکرولیتر پرایمر هگزامر تصادفی^[64]، به آن افزوده شد.
2- توسط آب فاقد نوکلئاز، حجم داخل هر ویال به 12 میلی لیتر رسید.
3- ویال به مدت 5 دقیقه در دمای 70 درجه­ سانتیگراد قرار داده شد تا واکنش اتصال پرایمر به RNA به خوبی صورت پذیرد.سپس مجددا ویال به روی یخ منتقل شد.
4- سپس به ویال مواد زیر اضافه شد:
جدول(3-5): مواد مورد استفاده در سنتزcDNA