مقدمه:سالمونلاانتریکا سبب ایجاد سالمونلوزیس در انسان می شود. سالمونلا انتریکا سرووار انتریتیدیس، دومین سروتایپی می باشد که در سطح دنیا سبب ایجاد سالمونلوزیس می شود. تکنیک MLVA، یکی از روش های نوین ژنوتایپینگ جهت تمایز ایزوله های باکتریایی در همه گیری ها و یا تعیین قرابت فیلوژنتیکی این ایزوله ها می باشد. هدف از این پژوهش، ژنوتایپینگ سویه های سالمونلا انتریتیدیس جدا شده از نمونه های بالینی در تهران بر پایه ی روش MLVA.
مواد و روش ها: در این پژوهش، ۵۱ ایزوله ی سالمونلا انتریکا سرووار انتریتیدیس از نمونه های بالینی در طی سال های ۱۳۸۷ تا ۱۳۸۹ در تهران جدا شدند. ایزوله های سالمونلا انتریتیدیس با بهره گرفتن از تکنیک های بیوشیمیایی و سرولوژیکی تایید شدند. جهت انجام تکنیک MLVA، از هشت لوکوس VNTR استفاده شد.
نتایج: ۱۰ ژنوتایپ متفاوت MLVA، در این پزوهش شناسایی شد. با بهره گرفتن از روش MST، ۵۱ ایزوله ی سالمونلا انتریتیدیس در ۲ کلونال کمپلکس قرار گرفتند. همچنین با بهره گرفتن از تکنیک NJ، این ایزوله ها در دو کلاستر جای گرفتند.
بحث و نتیجه گیری: نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که تکنیک MLVA، یک روش قدرتمند و آسان می باشد و می توان از این تکنیک در اپیدمی ها ی ناشی از سالمونلا انتریتیدیس استفاده نمود.
کلمات کلیدی: سالمونلا، MLVA، VNTR

کلیات تحقیق

1. 1. بیان مسئله

سالمونلا^[۱] باسیل گرم منفی،واجدتاژک پری تریش وجزءخانواده­ی­انتروباکتریاسه­می­باشد.گروه سالمونلا شامل یک جنس منفرد به نام سالمونلا است. این جنس شامل ارگانیسم هایی است که قبلا تحت عنوان سالمونلا و آریزونا شناخته می شدند. وقتی سالمونلا ها از طریق مسیر خوراکی به انسان و حیوانات منتقل شوند، بیماریزا هستند. این باکتری از طریق حیوان و فروارده های حیوانی به انسان سرایت می کنند و موجب تب روده ای، مسمومیت های غذایی و گاستروانتریت در انسان می شوند(۷).
طبقه بندی سالمونلا در طی سالیان متمادی دچار تغییرات زیادی شده است. سالمونلا گروه بزرگی از باکتری های روده ای شامل تقریبا ۲۲۰۰ سروتایپ می باشد. بر مبنای مدل اخیر طبقه بندی CDC تنها یک گروه منفرد از سالمونلا وجود دارد که به هفت زیر گروه(۱،۲،،a3،b3،۴،۵،۶) طبقه بندی می شوند. طبقه بندی اخیر بر مبنای شباهت ژنتیکی ایزوله های سالمونلا) ۱۶S r RNA) است. سیستم های طبقه بندی قدیمی تر شامل ۱) طبقه بندی کافمن_وایت: که هر سروتایپ را به صورت یک گونه منفرد سالمونلا شناسایی می کند. ۲) سیستم ادواردز_اوینگ: که سالمونلاها را به سه گونه( سالمونلا کلراسوئیس، سالمونلا تایفی، سالمونلا انتریتیدیس) و صدها سروتایپ تقسیم بندی می کند. ۳) مدل هیبریداسیون DNA: که سالمونلا ها را به یک گونه به نام سالمونلا انتریتیدیس و زیر گونه های اریزونه^[۲]، بونگوری^[۳]، دی اریزونه^[۴]، انتریکا^[۵]، سالاما^[۶]،هاتنا^[۷]، تقسیم می نمایند که طبقه بندی CDC با کمی تغییر از همین طبقه بندی استفاده می کند (۴-۶).
روش های مختلفی برای جداسازی باکتری سالمونلا از نمونه های محیطی وجود دارند که شامل: روش های کشت سنتی و بیوشیمیایی، سرولوژی و مولکولی می باشد. در کشت سنتی از محیط های پیش انتخابی و اختصاصی نظیر S.S Agarو XLD Agar استفاده می شود. روش های سرولوژی براساس واکنش انتی بادی با انتی ژن تولیدی توسط باکتری می باشد.

استفاده از روش های سرولوژیک بدلیل تنوع گسترده خصوصیات آنتی ژنتیکی باکتریایی و نیاز به طیف گسترده و وسیعی از آنتی بادی ها و همچنین هزینه گزاف تولید و مصرف آن، به مرور جایگاه خود را از دست داده اند. تا کنون از روش های مولکولی متنوعی جهت ژنوتایپینگ گونه های مختلف سالمونلا استفاده شده است. به کارگیری این روش ها، اهمیت ویژه ای در پژوهش های اپیدمیولوژیکی دارد . با شروع عصر مولکولی دانشمندان رویکرد خود را از فنوتیپ به ژنوتیپ تغییر داده اند.
روش های مختلفی مثل Rep- PCR، RAPD- PCR، Ribotyping، PFGE، MLST و MLVA جهت ژنتوتایپینگ سویه های سالمونلا تا به حال مورد استفاده قرار گرفته است بطوریکه هریک ازاین­روش ها معایب و مزایایی دارند، که در این میان روش MLVA^[8] از روش هایی مولکولی جدید و نوینی جهت ژنوتایپینگ باکتریایی مطرح شده است و بر این اساس توسعه یافتهُ است(۷).
این روش با مزایایی که نسبت به تکنیک PFGE^[9] دارد روز به روز به اهمیت و محبوبیت آن افزوده می شود. بطوریکه در آینده جایگاه ویژه ای در بین اپیدمیولوژیست ها خواهد داشت. در تکنیک MLVA بطور خاص، توالی های تکراری پشت سر هم^[۱۰] مورد بررسی و ارزیابی قرار می گیرند و از نظر تعداد تکرار های VNTR^[11] با یکدیگر مقایسه می شوند. مجموعه ای از این تکرار ها بصورت دسته ای از اعداد که در اصطلاح پروفایل اللی^[۱۲] گفته می شود. برای هر سویه باکتری نمایش داده می شود و به عنوان یک کد اطلاعاتی برای آن سویه در نظر گرفته می شود. (۷)
MLVA دارای مزایای زیادی نسبت به PFGE می باشد. در MLVA تنها نیاز به دستگاه PCR است و این روش یک تکنیک PCR-bassed میباشد در حالیکه در PFGE نیاز به امکانات و تجهیزات مخصوص و پر هزینه است. در MLVA تنها داشتن DNA باکتری کافیست در حالیکه در PFGE نیاز به باکتری زنده است.هزینه MLVA به مراتب از PFGE کمتر است و بسیار سریع تر از آن انجام پذیر می باشد. و نکته بسیار مهم اینست که، داده های حاصل از MLVA از آنجایی که بصورت مجموعه ای از ارقام ذخیره می شود را می توان به راحتی در بانک های اطلاعاتی ذخیره نمود و با نتایج سایر پژوهشگران مقایسه نمود هر چند چنین چیزی در PFGE دیده نمی شود گرچه تلاش های مانند شبکه Plus Net در جهت حل این موضوع ایجاد شده است.به این ترتیب MLVA بعنوان یک تکنیک جایگزین PFGE برای کشور های در حال توسعه مطرح می باشد (۷).
هر گونه باکتریایی، توالی های VNTR مخصوص به خود را دارد که می توان با طراحی پرایمر برای آنها، الل مورد نظر را تکثیر داد و از نظر تعداد تکرار مورد بررسی قرار داد. در طرح حاضر سعی شده است ­با انتخاب توالی هایVNTR مناسب، یک روش جدید، کم هزینه، سریع برای ژنوتایپینگ سویه های سالمونلا انتریکا سرووار انتریتیدیس^[۱۳] بکار گرفته شود تا در آینده بتواند جایگزین روش های گرانقیمتی مانند PFGE شود و بتوان از آن در آزمایشگاه های تحقیقاتی که تنها تجهیز به دستگاه PCR باشند، استفاده نمود و بتواند به سرعت هر نوع اپیدمی را شناسایی کند و پژوهشگران بتوانند نتایج خود را با یکدیگر مقایسه نمایند(۷).
۱-۲- کلیات
۱-۲-۱، تاریخچه
دو دانشمند فرانسوی با نام های کومل^[۱۴] و لوئی^[۱۵] در اوایل قرن نوزدهم میلادی علائم کلینیکی تب تیفوئید را بررسی کردند. در سال ۱۸۲۳ میلادی برتونئو^[۱۶] به علت تورم غدد لنفاوی روده آن بیماری را به نام روده جوشان^[۱۷] نام گذاری نمود. کرهارد^[۱۸] در اپیدمی تیفوئید در فیلادلفیا ایالات متحده آمریکا در سال ۱۸۳۷ میلادی، تیفوس و حصبه را از متمایز کرد.در سال ۱۸۳۹ میلادی شونلین^[۱۹] تیفوس را به نام تیفوس اگژنتماتیکوس^[۲۰] و حصبه را تیفوس احشایی^[۲۱] نام گذاری نمود. در میان سال های ۱۸۴۹-۱۸۵۱ در انگلستان، جنر^[۲۲] با بهره گرفتن از علائم بیماری های تب دانه دار، حصبه را تشخیص داد و عامل آن را سالمونلا تایفی^[۲۳] نامید. اسم سالمونلا بر گرفته شده از دامپزشک آمریکایی به نام دکتر دانیال المر سالمون^[۲۴] می باشد که به پاس تحقیقات و زحمات گسترده این دانشمند نام گذاری شده است.هوپ^[۲۵] در سال ۱۸۸۶ از ادرار، فیفیر در سال ۱۸۸۵ از مدفوع، در سال ۱۸۸۸ ویلچور از خون سالمونلا را جدا نمودند.در سال ۱۸۹۶ سیکارد و ویدال آنتی بادی علیه سالمونلا را از خون جداسازی کردند (۲و۳) .
شکل ۱-۱: تصویر دکتر سالمون دامپزشک آمریکایی.
۱-۲-۲، باکتریولوژی سالمونلا
سالمونلا از اجزای خانواده انتروباکتریاسه می باشد که واجد تاژک پری تریش می باشد(۴) این باکتری از طریق حیوانات و محصولات حیوانی آلوده به این باکتری به انسان منتقل شده و سبب بیماری در انسان می شود(۴). سالیانه تخمین زده می شود ۱.۴ میلیون نفر در ایلات متحده آمریکا توسط سالمونلا بیمار می شوند(۸).
بیشتر سروتایپ های این باکتری برای انسان و اکثر حیوانات بیماریزا هستند. سالمونلا در دستگاه گوارش مهره داران یافت شده و بیماری های متعدد با علائم متفاوت را ایجاد می نماید(۹). یکی از علل مهم مسمومیت های غذایی در اروپا و ایالات متحده آمریکا، سالمونلا انتریکا سرووار انتریتیدیس می باشد. براورد شده است که ۹۳.۸ میلیون نفر سالانه در کل جهان به سالمونلا مبتلا می شوند که نتیجه آن ۱۵۵۰۰۰ مورد مرگ در سال می باشد.

شکل۱-۲: در شکل سمت چپ باکتری سالمونلا با تاژک پری تریش دیده می شود و در شکل سمت راست میزان شیوع باکتری سالمونلا در سطح جهان را نشان می دهد.
۱-۲-۳، تست ها و خواص بیوشیمیایی
این باکتری تست اندول و ONPG آن منفی بوده و لاکتوز را تخمیر نمی کند اما این باکتری متحرک بوده و تست سیترات و SH2 آن مثبت می باشد. واکنش آنتی بادی علیه آنتی ژن های Vi و H و O این باکتری مبنای سروتایپینگ سالنونلا است.
در حالیکه مبنای اصلی طبقه بندی سالمونلا سروتایپینگ آنتی ژن های سطحی می باشد اما اساس تفریق سروتایپ تایفی تست های بیوشیمیایی می باشد . سروتایپ تایفی از نظر تست های بیوشیمیایی به صورت خنثی می باشد. سروتایپ تایفی در همه تست های تولید گاز از گلوکز، موسینات،آرابینوز، سیمون سیترات، اورنی تین دکربوکسیلاز و مصرف استات منفی را بروز می دهد. سروتایپ تایفی مسئول تیفوئید بوده و سایر سروتایپ ها باعث انتریت و انتروکولیت می شود(۴, ۹, ۱۰).
ویژگی های بیوشیمیایی سالمونلا همان ویژگی های عمومی خانواده انتروباکتریاسه می باشد. تخمیر کربوهیدرات توسط سالمونلا همراه با تولید گاز و اسید می باشد. سالمونلا مانیتول، آرابینوز، گلوکز، دولسیتول، سوربیتول و مالتوز را تخمیر می کند اما سالیسین، آدنیتول، لاکتوز و ساکارز را تخمیر نمی کند ولی سالمونلا کلراسوئیس و تعدادی از سویه های سالمونلا تایفی، قادر به تخمیر آرابینوز نیستند. سالمونلا کلراسوئیس، سالمونلا پولروم، برخی از سویه های سالمونلا پاراتایفی و تقریبا تمام سویه های سالمونلا تایفی قادر به تخمیر دولسیتول نمی باشند. سالمونلا گالیناروم، برخی از سروتایپ های سالمونلا تایفی موریوم، سالمونلا تایفی و سالمونلا دابلین هنگام تخمیر کربوهیدرات، گاز ایجاد نمی کند. برخی از سویه ها قادر به تخمیر ساکارز، رافینوز و لاکتوز هستند، این ویژگی های غیر عادی بدلیل وجود پلاسمید است. اکثرا سالمونلا آریزونه واجد فعالیت بتاگالاکتوزیداز می باشد و لاکتوز را یا به سرعت و یا به آهستگی تخمیر می کند. بیشتر سویه هایی که قند های خاص را تخمیر میکنند، این عمل را با شدت بالا انجام می دهند و در آب پپتون دار در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد و در مدت زمان ۶ تا ۱۰ ساعت، اسید تولید می کنند. ممکن است سویه های غیر تخمیر کننده در اثر چهش به تخمیر کننده تبدیل شوند و بعد از گذشت چند روز اسید ایجاد کنند و امکان دارد با سایر سالمونلا ها که تخمیر کننده هستند، اشتباه گرفته شوند. برخی از سویه ها دارای نقص در فرایند جذب قند هستند و اسید را در طول مدت ۱۰ الی ۲۰ ساعت ایجاد می کنند(۴).
۱-۲-۴، طبقه بندی سالمونلا
طبقه بندی سالمونلا بسیار دشوار است، به علت اینکه از گونه های متععدی تشکیل شده است. معمولا گونه های سالمونلا را بر اساس ویژگی های بیوشیمیایی، اپیدمیولوژی، میزبان و آنتی ژن های O، H و Vi طبقه بندی می شوند. برای اولین بار در سال ۱۹۲۹ میلادی طبقه بندی سالمونلا توسط کافمن صورت گرفت که توسط وایت این طبقه بندی تکمیل گردید. بر اساس این طبقه بندی، سروتایپ های سالمونلا در یک گونه منفرد قرار گرفت. طبقه بندی دیگری که وجود دارد،ادواردز-اوینگ^[۲۶] می باشد که سالمونلا را در سه گونه ی سالمونلا تایفی، سالمونلا کلراسوئیس و انتریتیدیس و صد ها سروتایپ طبقه بندی می کند(۴و۱۰).
طبقه بندی سومی که برای سالمونلا وجود دارد، بر اساس هیبریداسیون DNA^[27] می باشد. که بر اساس آن جنس سالمونلا شامل دو گونه ی سالمونلا بونگوری و سالمونلا انتریکا می باشد. در این طبقه بندی اکثر پاتوژن های انسان در گونه ی انتریکا جای گرفته اند.
سالمونلا انتریکا به شش زیر گونه تقسیم می شودکه شامل: سالمونلا انتریکا، سالمونلا سالاما، سالمونلا آریزونه، سالمونلا دی آریزونه، سالمونلا هونته و سالمونلا انتریتیدیس می باشد(۵).
جدول۱-۱، ویژگی های بیو شیمیایی سالمونلا