وان:

تعیین ترادف اپرون ار. ان. ای ریبوزومی و آنالیز فیلوژنتیکی فیتوپلاسماهای همراه با بیماری تورم جوانه بادنجان در استان بوشهر

استاد راهنما:

دکتر محمد صالحی

استاد مشاور:

دکتر ساغر کتابچی

تکه هایی از متن به عنوان نمونه :
چکیده
پیشتر بیماری تورم جوانه بادنجان و گوجه فرنگی به عنوان یک بیماری شایع و خسارتزا از استان بوشهر گزارش شده است. تحقیق مذکور بوته های آلوده بادنجان و توتون استان بوشهر متعلق به مناطق بنداروز، برازجان، بوشهر و کنگان را پس از انتقال به آزمایشگاه مرکز تحقیقات کشاورزی و منبع طبیعی فارس-زرقان مورد بررسی و مطالعه قرار داده و ذکر نموده است که جدایه های مورد مطالعه بر اساس علائم ایجاد شده در گیاه پروانش به سه گروه تقسیم می شوند. RFLP ژن ریبوزومی ۱۶S نیز نتایج داده های بیولوژیک را تایید کرده است. پیرو تحقیق مذکور، در این تحقیق تعداد شش جدایه شامل پنج جدایه از بادنجان و یک جدایه توتون موجود بر روی گیاه پروانش انتخاب و دی.ان.ای استخراج شده از بافت­های گیاهی (نمونه های برگ پروانش) طبق روش پیشنهادی مایکسنر و همکاران (۱۹۹۵) در آزمایش های بعدی مورد استفاده قرار گرفتند. در آزمون PCR با بکارگیری جفت آغازگر P1/P7 ناحیه اپرون ار. ان. ای ریبوزومی جدایه های مذکور تکثیر گردید. هضم محصول PCR با آنزیم های Rsa I و Hinf I جدایه های مورد مورد تحقیق را به ۳ گرو تقسیم کرد (جدای های ۱،۴ و ۵ در یک گروه، جدایه ۲ در یک گروه و جدایه ۳ و ۶ در گروه دیگر)، آنزیم Hae III جدایه ها را به دو گروه تقسیم کرد (۱، ۲، ۴ و ۵ در یک گروه و جدایه های ۳ و۶ در گروه دیگر) ولی آنزیم Alu I نتوانست مابین جدایه ها تمایز حاصل کند. قطعه­های تکثیر شده در آزمون PCR با استفاده ازIns T/A clone PCR Product Cloning Kit (MBI Fermentas) در پلاسمید PTZ57R/T وارد و در سویه DH5α باکتری Escherichia coli همسانه سازی گردید. آنالیز ترادف نوکلئوتیدی نتایج آزمون RFLP را تایید و جدایه ها را در سه گروه قرار داد. لازم به ذکر است آنالیز فیلوژنتیک ناحیه اپرون ریبوزومی گروه یک را به دو زیر گروه تقسیم کرد بطوری که جدایه ۱، ۴ را در یک زیر گروه و جدایه ۵ در زیرگروه دیگر قرار گرفت. علاوه بر این جدایه های گروه ۲ (جدایه های ۳ و ۶) نیز هر کدام در یک زیر گروه قرار گرفتند. البته جدایه ۳ با داشتن یک جایگاه برشی اضاف تر در موقعیت ۹۳۸ با آنزیم برشی Hpa II می تواند از جدایه ۶ متمایز گردد.
۱-۱- مقدمه
براساس خوش­بینانه ترین برآوردها، جمعیت جهان در پایان نیمه اول قرن بیست و یکم از مرز ده میلیارد نفر خواهد گذشت. این در حالی است که بانک جهانی در سال ۱۹۹۴ اعلام کرده حدود هشتاد و سه درصد از این جمعیت مربوط به کشور های در حال توسعه می باشد. بدون شک مهمترین و حیاتی ترین نیاز این جمعیت عظیم غذا و امنیت غذایی می­باشد. مطمئنا از طریق افزایش بهره وری، استفاده مناسب از وسایل و منبع تولید از جمله آب، خاک، نیروی انسانی آموزش دیده و. می­توان به تولید پایدار دست یافت و در نهایت بخشی از امنیت غذایی تامین کرد. در این مبحث حفاظت از گیاهان، کنترل آفات، بیماریها و      علف های هرز حائز اهمیت فوق العاده می­باشد. بعنوان مثال برابر تخمین وزارت کشاورزی آمریکا بیماریهای گیاهی سالانه ۹.۱، آفات ۷.۷ و علف های هرز ۶.۲ میلیارد دلار فقط در ایالات متحده خسارت وارد می­ کنند. خسارت گیاهی ناشی از آفات و بیماری ها نه تنها در عرضه مواد غذایی در سطح ملی و بین المللی تاثیر دارد بلکه بر زندگی زارعی که گیاه را برای مصرف مستقیم خود یا حتی برای فروش کاشته است نیز تاثیر خواهد گذاشت.
رده مالیکیوت­ها گروهی از پروکاریوت­های فاقد دیواره سلولی بوده که از نظر تکاملی از باکتری­های گرم مثبتی که درصد مجموع سیتوزین و گوانین پایین دارند مشتق شده اند. بعضا این گروه توانایی بیماریزایی در گیاهان را دارند. از بیمارگرهای گیاهی واقع در این گروه می توان به اسپیروپلاسماها (دارای سلول های مارپیچ، متحرک و قابل کشت) و فیتوپلاسماها (سلول های غیر مارپیچ و غیر قابل کشت) اشاره کرد (Weisburg et al. 1989). از زمان کشف فیتوپلاسماها در سال ۱۹۶۷ میلادی تا کنون بیش از صد ها بیماری همراه با فیتوپلاسما در بیش از ۳۰۰ جنس گیاهی شناخته شده است (Lee et al., 2000, McCoy et al., 1979 and Seemuller et al., 1998).
فیتوپلاسماها با نام قبلی شبه مایکوپلاسما(MLO) (IRPCM, 2004) محدود به آوند های آبکشی گیاهان میزبان و همچنین همولنف حشره ناقل می­باشند (Lee et al., 2000). این گروه از بیمارگرهای گیاهی در طبیعت توسط ناقلین مکنده که عمدتا زنجرک­های برگی(Leafhopper) بوده و متعلق به خانواده Cicadellidae می­باشند (Lee et al., 2000) با روش پایا و تکثیری (Firrao et al., 2005) گسترش پیدا می­ کنند. البته در مواردی پسیل ها نیز بعنوان ناقل اینها گزارش شده اند (Lee et al., 2000). بیماری های فیتوپلاسمایی اغلب باعث عقیمی و مرگ گیاه میزبان شده و معمولا دارای خسارتی کم و بیش معادل صد در صد می باشند که این خسارت شامل کاهش کیفیت و کمیت محصول می­باشد.
در ایران تاکنون پیرامون بیماری های فیتوپلاسمایی تحقیقات گستردهای انجام شده است (صالحی و همکاران ۱۳۸۵). یکی از بیماری های مهم فیتوپلاسمایی در ایران بیماری تورم جوانه در بادنجان، گوجه فرنگی و توتون می باشد (صالحی و ایزدپناه ۱۳۷۷، صالحی و همکاران ۱۳۷۹ و رئوفی و همکاران ۱۳۸۹). علائم در این بیماری شامل: گل سبزی، برگ سانی، تورم جوانه، عقیم شدن، کاهش تعداد و اندازه گل، ازدیاد جوانه های جانبی ساقه، جاروئی شدن انتهای ساقه، طویل شدن غیر معمول میانگره، ریز برگی، تغییر رنگ برگها و جوانه ها، پیچیدگی و قاشقی شده برگها، سرخشکیدگی، زوال و مرگ گیاه می­باشد (Lee et al., 2000).
حدود ۴۸۳ هزار هکتار از اراضی کشور سالانه (سال زراعی ۸۵-۱۳۸۴) به گروه سبزی جات اختصاص داشته است. حدود نیمی از این مقدار در ۷ استان خوزستان، فارس، کرمان، اصفهان، هرمزگان، آذربایجان شرقی و همدان کشت شده است. استان بوشهر در این سال با کشت حدود ۷۵/۳ درصد سبزیجات مقام ۱۳ را به خود اختصاص داده است. از ۱۷ هزار هکتار سطح زیر کشت در این استان حدود ۱۴ هزار هکتار به محصول گوجه فرنگی و حدود ۲ هزار هکتار به سایر سبزی جات از جمله بادنجان، فلفل و. اختصاص داشته است. علاوه بر موارد ذکر شده، استان بوشهر مقام اول تولید گوجه فرنگی خارج از فصل را در کشور به خود اختصاص داده است (آمارنامه کشاورزی ۱۳۸۴).
بیماری تورم جوانه در گیاهان بادنجان، گوجه فرنگی و توتون یکی از مهمترین بیماری های
سیفی جات می باشد (Shew and lucas1991). بیماری تورم جوانه پیشتر از مزارع ورامین-اطراف کرج (اسکندری و همکاران ۱۳۴۹) فارس (صالحی و همکاران ۱۳۷۴) استانهای اردبیل اصفهان و آذربایجان غربی (رشیدی و همکاران ۱۳۸۵) و خراسان (جمشیدی و همکاران ۱۳۸۹) گزارش شده است. این بیماری دارای خسارات عمده و چشمگیری در استان بوشهر و به ویژه مناطق برازجان، کنگان و بنداروز می­باشد (رئوفی و همکاران ۱۳۸۹). بررسیهای سالهای ۱۳۸۷ و۱۳۸۸ نشان داد که این بیماری در اکثر مزارع بادنجان استان بوشهر وجود دارد. با توجه به علائم ناشی از مایه زنی عامل بیماری تورم جوانه بادنجان به گیاه پروانش و مقایسه چند شکل طولی قطعات برشی محصول واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR-RFLP) نشان داد که فیتوپلاسماهای عامل تورم جوانه بادنجان در استان بوشهر متنوع است و حداقل به سه گروه تقسیم می­شوند. (رئوفی و همکاران ۱۳۸۹).
با توجه به اهمیت بیماری و اینکه ماهیت فیتوپلاسمایی عامل بیماری به ویژه از نظر گروهبندی و شباهت و یا تفاوت با فبتوپلاسماهای دیگر در ایران و دنیا مشخص نشده بود، در تحقیق حاضر مطالعات زیر انجام گردید.
۱- انتقال همزمان عامل جدایه های مختلف بیماری تورم جوانه به پروانش های همسن و مقایسه علائم بیماری در آنها
۲- تکثیر یک قطعه ۱۸۰۰ جفت بازی از اپرون ار. ان. ای ریبوزومی در آزمون PCR با جفت آغازگر P1/P7
3- RFLP فیزیکی محصول PCR با آنزیم های Alu I، Hinf I، Hae III و Rsa I
4- همسانه سازی و تعیین ترادف محصول PCR
5- انجام آنالیز های مختلف مولکولی شامل جستجو با برنامه بلاست، بررسی میزان همولوژی، ترسیم درخت فیلوژنتیکی، RFLP کامپیوتری و در نهایت تعیین موقعیت فیتوپلاسما (فبتوپلاسماهای) عامل تورم جوانه در بین فیتوپلاسماها از نظر گروه های اصلی و زیرگروه ها
-۱-بادنجان
۲-۱-۱-تاریخچه بادنجان
این گیاه بومی آسیا بوده و احتمالا در مناطقی از هندوستان و یا چین کشت می­شده است. در هندوستان کشت این گیاه دارای قدمت تاریخی بالایی می­باشد. و طبق مدارک موجود در قرن پنجم کشت این گیاه در چین مرسوم بوده ولی اروپا قدمت چندانی در کشت این محصول ندارد (Singh et al., 1997 and Splittstosser 1990). به­نظر می رسد که مسلمانان در گسترش این گیاه به اروپا نقش عمده و موثری داشته اند (مبلی و پیراسته ۱۳۷۳).
۲-۱-۲- مشخصات گیاه شناسی
گیاهی یک­ساله متعلق به نهاندانگان دولپه بوده ولی بسته به شرایط آب و هوایی می تواند بیش از یک سال نیز دوام بیاورد (Halfaere and Barden 1979). این گیاه متعلق به تیرهSolanaceae و با نام علمی Solanum melogenaمی باشد. ساقه این گیاه قوی، خشن و چوبی بوده و ارتفاع آن می ­تواند به ۶۰ سانتی متر تا یک متر برسد. برگ های پهن و کشیده آن بصورت متناوب روی ساقه قرار می­گیرد و ممکن است با کرک پوشیده شده باشد. میوه این گیاه قلمی یا کشیده با رنگهای ارغوانی، سیاه، بنفش، بنفش مایل به سیاه و یا سفید است. بهترین دما جهت رشد بادنجان ۳۲-۲۶ درجه سانتی گراد در روز و ۲۶-۲۱ درجه در شب می باشد (Halfare and Baren 1979). این گیاه نسبت به گوجه فرنگی حساسیت بیشتری به سرما دارد (Ware and McCollum 1980).
2-1-3-ارقام بادنجان:
۲-۱-۳-۱- بادنجان پاکوتاه (Dwarf eggplant):
نام علمی این واریته Solanum melonena Var. depressumمی­باشد. میوه بسیار کوچک، بنفش رنگ و گلابی شکل است. طول دوره رشد کوتاه می باشد (شیبانی ۱۳۶۷).
۲-۱-۳-۲-بادنجان قلمی (Snake eggplant):
نام علمی این واریته Solanum melogena Var. serpentinum می­باشد. میوه در این نوع بسیار دراز و باریک به طول ۳۰-۲۵ سانتی متر و قطری در حدود ۴-۳ سانتی متر می­باشد (شیبانی ۱۳۶۷).
۲-۱-۳-۳-بادنجان معمولی (Common eggplant):
نام علمی این واریته Solanum melogena Var. esculentumمی­باشد. ارتفاع بوته در این بادنجان تا ۱۲۰ سانتی متر نیز می­رسد. طول میوه ۴-۳ برابر قطر آن می­باشد (شیبانی ۱۳۶۷).
۲-۲-گوجه فرنگی
۲-۲-۱-تاریخچه
یکی از مهمترین سبزی­های دنیاست. ممکن است بومی آمریکای مرکزی باشد (Halfaere and Barden 1979) ولی برخی منابع موطن آنرا آمریکای جنوبی می دانند (قادری ۱۳۵۳، Halfare and Barden 1979). نام گوجه فرنگی (Tomato) گرفته شده از یک کلمه مکزیکی بنام Tomati می­باشد (Rodale et al., 1977). در ابتدا گوجه فرنگی را یک گیاه زینتی محسوب می­کردند (Nonnecke 1989) و میوه آنرا سمی می­دانستند (Everett 1984). در سال ۱۹۵۶ این گیاه به اروپا انتقال داده شده است (Everett 1984).
2-2-2-مشخصات گیاه شناسی
نام علمی این گیاه Lycopersicum esculentum بوده و به تیره Solanaceae تعلق دارد. این گیاه می تواند در مناطق سردسیر بصورت گیاهی یک ساله و یا در مناطق گرمسیر بصورت گیاهی چند ساله مطرح باشد (Janick 1989 and Gollan 1992). برگها مرکب و ساقه جوان آن پوشیده از کرک های ریز و سفید می­باشد. ساقه در هنگام جوانی گیاه سبز، کرک دار، گرد و خیلی شکننده است. برگ های مرکب بصورت متناوب روی ساقه قرار دارند. گل در این گیاه کامل (Perfect flower) و هر خوشه بین ۸-۴ گل دارد (Halfaere and Barden 1979). این گیاه به طول دوره روشنایی در روز حساس نبوده ( Nonnecke 1989) ولی چنانچه میزان روشنایی کمتر از ۵ ساعت باشد یا اینکه در معرض روشنایی دائم باشد میوه نمی­دهد (Splittstoesser 1990). بهترین دما جهت رشد ونمو این گیاه ۲۹-۱۹ درجه
سانتی­گراد می­باشد (Ware and Mccollun 1959) و در دمای بالای ۳۵ درجه رشدش متوقف و میوه تشکیل نمی­ شود (Ware and Mccollum 1980) در دمای پایین تر از ۱۵ درجه امکان تلقیح برای گلها وجود ندارد (Nonnecke 1989).
2-2-3-ارقام گوجه فرنگی