R-OH+H2O+NADP  RH+O2+NADPH+H+
در واکنش فوق RH می تواند نماینده انواع بسیار متفاوتی از مواد گزنوبیوتیک باشد . سیتوکروم P450 آنزیمی است که دارای متنوع ترین انواع سوبسترا می باشد. مکانیسم واقعی این واکنش پیچیده است .
با بهره گرفتن از۲O18 نشان داده اند که یک اتم اکسیژن وارد مولکول R-OH و یک اتم اکسیژن وارد مولکول آب می شود. وجود دو سرنوشت برای مولکول اکسیژن دلیل نامیدن آنزیم های منواکسیژناز به نام قدیمی «آنزیم های اکسیداز دارای عملکرد مختلط» است. این واکنش را می توان به صورت زیر نشان داد:
سیتوکروم P450 اکسید  سیتوکروم P450 احیاء
RH+O2  R-Oh+H2
سیتوکروم P-450 یک سیستم آنزیمی کوپل شده، شامل ۲ آنزیم می باشد:
آنزیم هایNADPH ـ سیتوکروم P450 رداکتاز (یک فلاوو پروتئین) و سیتوکروم P450 (یک هموپروتئین) در ماتریکس فسفولیپیدی غشاء شبکه آندوپلاسمی قرار می گیرند. نام سیتوکروم P450 به این جهت می باشد که وقتی سیتوکروم P-450  احیاء می شود، تشکیل یک کمپلکس با کربن منواکسید می دهد که ماکزیمم جذب آن در nm450 است و وقتی که تغییر ماهیت داد سیتوکروم P-450 دارای جذب حداکثر در nm420 مشابه دیگر هموپروتئین ها می گردد.
۱-۷-۲- واکنش های آنزیمی فاز II
به طور کلی واکنش های مرحله I ، مواد گزنوبیوتیک را به مشتقات هیدروکسیله قطبی تر تبدیل می کنند. واکنش های مرحله II موجب کونژوگاسیون این مشتقات با مولکول هایی نظیر گلوکورونیک اسید، سولفات یا گلوتاتیون می شوند، این امر قابلیت انحلال این مشتقات را در آب افزایش داده و سرانجام آنها را از طریق ادرار یا صفرا دفع می کند. این واکنش ها معمولاً در کبد رخ می دهند . یکی از مهمترین واکنش های آنزیمی فاز II، کنژوگاسیون گزنوبیوتیکها با گلوتاتیون توسط آنزیم گلوتاتیون S- ترانسفراز می باشد که در ذیل به اختصار توضیح داده می شود.
۱-۷-۲-۱- گلوتاتیون S- ترانسفرازها
۱-۷-۲-۱-۱- نحوه عملکرد آنزیم های گلوتاتیون S- ترانسفرازها
این گروه آنزیمی، حمله نوکلئوفیل گلوتاتیون را به مراکز الکتروفیل موجود در سوبسترا کاتالیز
می کند . و با کنژوگاسیون ترکیبات شیمیایی با منشاء داخلی و خارجی با گلوتاتیون، حلالیت آنها را در آب افزایش داده و در نهایت به صورت مرکاپتوریک اسید که در آب محلول می باشد از طریق صفرا، مدفوع و ادرار از بدن خارج می کنند گلوتاتیون (  – گلوتامیل سیستئینیل گلیسین) یک نوع تری پپتید است که متشکل از اسیدگلوتامیک، سیستئین و گلیسین می باشد. گلوتاتیون را معمولاً به صورت اختصاری GSH نشان می دهند. چندین واکنش موجب کونژوگاسیون ترکیبات گزنوبیوتیک الکتروفیل بالقوه سمی (نظیر برخی مواد سرطانزا) با ترکیب نوکلئوفیل GSH می شوند، این واکنش ها را می توان به صورت زیر نمایش داد:

این آنزیم ها مرحله ابتدایی در تشکیل مشتقات N- استیل سیستئین (مرکاپتوریک اسید) در مسیر متابولیکی ترکیبات خارجی یا متابولیت های آندوژن حاصله از فاز I را کاتالیز می کنند.
سوبسترای گلوتاتیون S- ترانسفراز، می تواند با گلوتاتیون به صورت غیر آنزیمی نیز واکنش دهد، اما سرعت آن از واکنش کاتالیز شده به وسیله آنزیم کمتر است. مولکول گلوتاتیون به دلیل داشتن cys دارای گروه، تیول می باشد (SH). گوگرد گروه عاملی به علت داشتن الکترون آزاد دارای خاصیت هسته خواهی (نوکلئوفیل) است، در نتیجه گلوتاتیون از طریق عنصر گوگرد خود می تواند به مرکز الکترون خواه (الکتروفیل) منتقل گردد که واکنش مذکور به کمک گلوتاتیون S- ترانسفراز کاتالیز می شود.
بنابراین بسیاری از ترکیبات آلی با هسته الکتروفیل نظیر: آلکیل ها، هالیدها، آریل هالیدها، استروئیدها، پراکسیدهای آلی، بیلی روبین، پروستاگلاندین ها و بسیاری از ترکیبات آندوژن و اگزون، دیگر سوبسترای مناسبی برای GST می باشند تا اینکه با مولکول گلوتاتیون کنژوگه شوند.
علاوه بر کاتالیزور کنژوگاسیون زنوبیوتیک ها با گلوتاتیون، GST در یک سوی واکنش نهایی شرکت می کند که محصول نهایی آن مرکاپتوریک اسید نمی باشد بلکه دو مولکول گلوتاتیون اکسید شده (GSSG) و یک سوبسترا احیاء می گردد. اصول کلی آن به صورت زیر است:

از سوبسترای این دسته از واکنش ها می توان نیترات های آلی و هیدروپراکسیدهای آلی را نام برد .
اگرچه کنژوگه شدن با گلوتاتیون به عنوان مسیر سم زدایی در نظر گرفته می شود ولی در بعضی از مواد می توانند پس از کنژوگه شدن محصولات فعال تر یا سمی تری را تولید کنند .
۱-۸- سیاه دانه[۴۹]
سیاه دانه که معمولاً به نام زیره سیاه و سینوج[۵۰] در کشور تونس نامیده می شود, سالیانه یک بار در نقاط مختلف جهان که نزدیک به دریای مدیترانه هستند کشت می شود. این دانه ها معمولاً برای مزه غذا و موارد داروئی استفاده می شوند. آن ها اصولاً در غذاهای سنتی شیرین، عسل، یا روی نان و محصولات مختلف پنیر استفاده می شود. این دانه ها در طب سنتی استفاده می شود و بعنوان یک درمان طبیعی برای بیماری های متعددی مثل آسم، فشار خون، دیابت، التهاب، سرفه، برونشیت، اگزما، تب، سرگیجه، آنفولانزا و داروی ضد نفخ، و کرم ها به کار می روند(۳۰).
مطالعات گسترده ای درباره خواص دارویی عصاره سیاه دانه از جمله همراه اتانول و متانول و عصاره های مایع انجام شده است. در حالی که برخی از جاها گزارشاتی در مورد فعالیت های بیولوژیکی اسانس روغن سیاه دانه داده شده است. خواص بیولوژی از اسانس روغن پیدا شده مست

قیماً مربوط به ترکیبات شیمیایی آن می شود. که تحت تاثیر منشا طبیعی گیاهی قرار گرفته است. انواع ترکیبات شیمیایی در یک نوع از اسانس روغن ایرانی سیاه دانه پیدا شده است که بیشتر اجزای آن فنیل پروپانوئید[۵۱]است. در حالی که ترکیبات شیمیایی با ۳۳% فسفر و تیمول[۵۲]۲۶٫۸% و مزیت مونو ترپن[۵۳]برای روغن اسانسسیاه دانه از مراکش گزارش داده شد. علاوه بر این بنکاکی و همکارانش در سال ۲۰۰۷ تفاوت قابل توجهی در ترکیبات شیمیایی روغن اسانسسیاه دانه الجزایری نشان داده اند.این روغن از الکل و اسید و هیدرو کربن های مونوترپن[۵۴]تشکیل شده است. هدف از این مطالعات که برای اولین بار انجام شد این بود که فعالیت آنتی اکسیدان مانند فعالیت های ضد سرطان، ضد تورم و ضد باکتری اسانس روغن سیاه دانه را تخمین بزنند(۳۰).
تحقیقات جدید داروشناسی طیف وسیعی از خواص ضد التهاب، ضد باکتری ، ضد قارچ و ضد انگلی را نشان داده است. اثر سیاه دانه در مطالعات کلینکال و حیوانی ارزیابی شده است. بیشتر فعالیت ها به روغن پایه به دست آمده از آماده سازی دانه های سیاه نسبت داده شده است.تیموکوئینون[۵۵] و دیتیموکوئینون[۵۶]اجزا اصلی فعال روغن پایه هستند، که برای سلول های تومورهای مقاوم وابسته و چند دارویی سیتوتوکسیک[۵۷]هستند.نیجلون[۵۸],پلیمر کربنیل ازتیموکوئینون ، که غلظت کمی دارند در مهار کردن انواع حساسیتها موثر بوده است.مشخص شده که فعالیت اصلی دانه های سیاه دانه که شامل اسیدهای چرب می شود به طور کامل از سرطان ارلیش آسیت[۵۹]در موش ها جلوگیری می کند(۳۰).
داروهای گیاهای محصولات طبیعی هستند که از گیاهان و عصاره آن ها به صورت سنتی برای درمان بیماری های مختلف یا ارتقاء سطح سلامت استفاده می شود. تحقیق بر روی داروهای گیاهی و جایگزینی های طبیعی و درک مکانیزم آن ها در عملشان در بدن رو به رشد است. بسیاری از تحقیقات بر جایگزینهای طبیعی گرفته شده از گیاهان متمرکز شده است که می توانند بعنوان مدل های دفاعی برای کنترل خروجی واکنش های دفاعی مختلف نشان داده شوند(۳۱).
سیاه دانه از دسته گیاهان بومی آسیای جنوب غربی است، اما در نقاط مختلف دنیا نظیر اروپای جنوبی و آفریقای شمالی کشت می شود.در هزاران سال و بسیاری از فرهنگ ها به طور سنتی از سیاه دانه بعنوان مزه، افزودنی غذا استفاده کرده اند، همان طور که از آن بعنوان داروی گیاهی برای بیماری های مختلف نظیر آسم، اسهال، سردرد، دندان درد، و انواع مختلف سرطان ها استفاده کرده اند.اگرچه بعضی از تحقیقات که بر پتانسیل سیستم دفاعی اثرات دارویی سیاه دانه ، متمرکز شده اند، اما استفاده از آن هنوز بسیار کم است(۲)
فصل دوم
مواد و روش کار

۲-۱- تیمار حیوانات

در این تحقیق، از رت های نر بالغ با وزن متوسط ۱۰۰ گرم استفاده گردید که از مرکز نگاهداری حیوانات آزمایشگاهی از انستیتوپاستور ایران خریداری شدند.

۲-۱-۱ -القاء سرطان کولون در رتها

القاء سرطان کولون در رت ها توسط یک ماده کارسینوژن به نام ۱و ۲- دی متیل هیدرازین DMH)) صورت گرفت. DMH بلافاصله قبل از تزریق در EDTA 1 میلی مولار حل گردید و به منظور پایداری کارسینوژن، pH آن به کمک سود ۱/۰ نرمال به ۵/۶ رسانده شد. سپس DMH به صورت زیر جلدی (s.c) در ناحیه کتف، به مدت ۱۸ هفته ، هفته ای ۱ بار هر بار در دز mg/kg b.w30 و در حجم ۵۰۰ میکرولیتر ، به رتها تزریق شد. به گروه کنترل نیز همانند روش فوق ۵۰۰ میکرولیتر EDTA 1 میلی مولار تزریق شد. در این روش برای ایجاد سرطان ۶ ماه زمان لازم است.

۲-۱-۲- تیمار حیوانات با غذای حاوی پودر سیاه دانه

بازده اسانس به دست آمده از نمونه سیاه دانه ایرانی بسیار کم می باشد و متاسفانه گرفتن مقدار زیاد اسانس به منظور تیمار حیوانات با آن به مدت ۶ ماه امکان پذیر نیست و مستلزم صرف هزینه و زمان زیادی می باشد که مقرون به صرفه نیست. به همین دلیل با توجه به مطالعات انجام شده و تحقیق بسیار در این زمینه و مشاوره با متخصصین فیتوشیمیست و بیوشیمیست، تصمیم گرفته شد تا به جای اسانس از پودر سیاه دانه برای تیمار حیوانات در تحقیق استفاده گردد).
پودر سیاه دانه در غلظت های ۲ و ۴ درصد (وزنی/ وزنی) به غذای رت ها اضافه گردید. بدین ترتیب که غذای رت ها ابتدا به صورت پودر در آورده شد و سپس به ۱۰۰۰ گرم از آن حدود ۴۰۰ میلی لیتر آب اضافه شد تا کمی خیس گردد. سپس برای تهیه غذای حاوی پودر سیاه دانه ۲% و ۴% ، به ترتیب ۲۰ یا ۴۰ گرم از پودر سیاه دانه به آن افزوده و کاملا مخلوط گردید. سپس مخلوط حاصل مجددا به صورت پلت های کوچک در آورده شد و در هوای آزاد قرار داده شد تا خشک شود.
۲-۱-۳ -تهیه غذای رت ها
برای تغذیه رت ها به سه نوع غذا نیاز بود. غذای عادی ، غذای حاوی ۲% پودر سیاه دانه و غذای حاوی ۴% پودر سیاه دانه .
در تحقیقاتی که دکتر دادخواه و گروه همکار انجام داده بودند ، از پودر موجود در گونی های ۵۰ کیلویی غذای استاندارد موش که از انستیتو پاستور ایران تهیه می شد برای درست کردن غذای عادی و همچنین غذای حاوی پودرهای مورد نظر تحقیقات خود استفادهمی کردند که روندی طولانی و به علت کمبود پودر غذای استاندارد تهیه شده در انستیتو پاستور ایران وقت گیر بود .
از این رو و بر اساس استانداردهای موجود به این نتیجه رسیدیم که کنسانتره گاو شیری می تواند پودر تولید کند و تامین نیازهای غذایی رت ها را نیز بر عهده بگیرد . کنسانتره گاو شیری انتخابی محصول شرکت به پرور بود که پودر زیادی بدست می داد .