• آب مقطر

• سرنگ با سرسوزن گیج ۲۱

• رک لوله فالکون و فالکون­های ۱۵ و ۵۰ میلی لیتری استریل(شرکت Falcon آمریکا)

• پیپتگیر اتوماتیک (شرکت Eppondrof آلمان) پیپت در اندازه­ های ۵، ۱۰ میلی لیتری استریل

• سمپلر ۱۰۰ و ۱۰۰۰ میکرولیتری استریل

• تریپان بلو(شرکت Sigma آمریکا)

• لام نئوبار

• لامل سنگی

• پنبه، دستکش استریل

• الکل ۷۰% (شرکت رازی ایران)

روش کار

• پنبه آغشته به اتر داخل ظرف شیشه ­ای انداخته و تا بیهوشی رت، داخل آن نگه داشته شد.

• حیوان بیهوش شده به الکل ۷۰% آغشته شد، در وسط ناحیه شکمی و پایین تر از استخوان جناغ سینه برشی ایجاد و خون به طور مستقیم از قلب حیوان اخذ شد.

• با آماده سازی هود لامینار، در فالکون ۱۵ میلی لیتری، ml5 خون هپارینه (۱۰µl/ml) رت با حجم مساوی ۱:۱ از سرم فیزیولوژی ۹/۰ % رقیق شد.

• به طور جداگانه، ml1 از مگلومین در ۴ فالکون باml 3 سرم فیزیولوژی ۹/۰ % ورتکس شد.

• ml 2 خون رقیق شده توسط سمپلر ۱۰۰۰ میکرولیتری به آرامی در هر فالکون اضافه شد.

• فالکون­ها به مدت ۱۵ دقیقه با دورrpm/min 2400 سانتریفیوژ شد.

• مایع رویی رسوب سلولی خارج و رسوب حاصل را باµl 400 سرم فیزیولوژی ۹/۰ % همگن نموده و محتویات ۴ فالکون در یک فالکون ۵۰ میلی لیتری ریخته و µl500 سرم فیزیولوژی ۹/۰ % به آن اضافه گردید.

• در این مرحله جهت لیز سلولی گلبول­های قرمز، با بهره گرفتن از پیپت،ml 20 آب مقطر سرد استریل به مدت ۴۰-۳۰ ثانیه به فالکون اضافه و بلافاصلهml 10 سرم فیزیولوژی ۵۵/۲ % داخل فالکون ریخته و مخلوط گردید.

• فالکون به مدت ۵ دقیقه با دورrpm/min 2400 سانتریفیوژ شد (مرحله ۹و ۸ دو مرتبه تکرار شد).

• مایع رویی تخلیه و رسوب باml 1 دکستروز ۵% بخوبی همگن شد.

• زنده­مانی و تعداد سلول با بهره گرفتن از روش تریپان بلو تعیین گردید. در هر جداسازی تعداد/ml 10⁶×۴ جدا می­شد.

۳-۷- تیمار سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان رت با ویتامینD3(et al;2012 Klotz Artaza et al.,2010,)
با رسیدن سلول ها به ۷۰ درصد برآمدگی در روزهای ۱۰-۷ پس از کشت پاساژ سوم، فلاسک ها را از انکوباتور خارج کرده و به زیر هود لامینار فلو انتقال دادیم(۱۵دقیقه قبل از شروع کار هود روشن و زیر هود الکل پاشی گردیده بود) و تیمار سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان رت با غلظت های nm50،nm 100،nm 200 از ویتامینD3 انجام گرفت و فلاسک­های حاوی سلول­های بنیادی مزانشیما مغز استخوان رت تیمار شده با ویتامین D3 همراه با سلول­های بنیادی مزانشیمی تیمار نشده، به عنوان گروه کنترل به مدت ۲۴،۴۸و۷۲ ساعت انکوبه گردید.
۳-۸- مجاور­سازی سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان رت تیمار شده با ویتامین D3 و مایع رویی آنها با نوتروفیل های جدا شده از خون محیطی موش نژاد ویستار(et al;2012 Klotz Artaza et al.,2010,)
۳-۸-۱- مجاورسازی سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان رت تیمار شده با ویتامین D3 با سلول­های نوتروفیل

• پس از اتمام زمان انکوباسیون، تعداد ۱۰^۶×۵ سلول نوتروفیل جدا شده که از خون محیطی رت­ها به کمک مگلومین کامپاند(داروپخش- تهران)جدا سازی شده بودند به همراه ۵ سی­سی محیط کشت DMEM و۱۰درصد FBS به داخل فلاسک حاوی سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان رت تیمار شده و کنترل اضافه گردید و به مدت ۴ ساعت تحت شرایط ۳۷ درجه سانتی گراد با ۵ درصد CO₂ و رطوبت ۸۰ درصد انکوبه شدند. لازم به ذکر هست از سلولهای نوتروفیل مجاور نشده به عنوان کنترل مثبت استفاده گردید.

• بعد از گذشت مدت زمان انکوباسیون مایع رویی داخل فلاسک، داخل لوله فالکنml15 استریل جمع آوری و به مدت ۵ دقیقه با سرعت ۱۲۰۰ دور سانتریفیوژ گردید. پلت سلولی جهت انجام تست­های تکمیلی به صورت سوسپانسیون درآمد.

۳-۸-۲- مجاور سازی مایع­رویی سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان تیمار شده با ویتامین D3 با سلول­های نوتروفیل

• پس از اتمام زمان انکوباسیون، مایع­رویی سطح سلول­های بنیادی مزانشیمی موجود در فلاسکT25 در یک لوله فالکن ml15 استریل جمع­آوری گردید.

• مایع­رویی حاصله را به یک پلیت ۲۴ خانه ته تخت انتقال داده به طوری که کف خانه­ها با مایع­رویی پوشانده شد. سپس تعداد۱۰^۶×۵ سلول نوتروفیل به همراه۱۰ درصدFBS به داخل هر خانه حاوی مایع­رویی اضافه شد و سپس به مدت ۴ ساعت تحت شرایط ۳۷درجه سانتی گراد با ۵درصد CO₂ و رطوبت ۸۰ درصد انکوبه شدند.

• • بعد از گذشت مدت زمان انکوباسیون نوتروفیل­ها برای انجام تست­های تکمیلی جداسازی شدند.

۳-۹- فاگوسیتوز مخمر (Delirezh et al., 2010)
مراحل انجام این تست به دلیل تفاوت سلول مورد استفاده (نوتروفیل بجای مونوسیت و مخمر تازه کشت شده بجای پودر مخمر) با مقداری تغییر نسبت به رفرنس اشاره شده انجام گرفت.
۳-۹-۱- آماده سازی سوسپانسیون مخمر
مواد و وسایل مورد نیاز

• هود

• انکوباتور معمولی

• سانتریفیوژ

• کشت تازه ۲۴ساعته سویه استاندارد(PTCC5027) مخمر کاندیدا آلبیکنس^[۵۵] (تهیه شده از بخش قارچ شناسی گروه میکروبیولوژی دانشکده دامپزشکی ارومیه)

• محیط کشت RPMI 1640 (Gibco, UK)

• فسفات بافر سالین PBS (شرکت Sigma آمریکا)

• سرم تازه خون رت

• رک لوله فالکون و فالکون ۱۵ میلی لیتری استریل(شرکت Falcon آمریکا)