دانشگاه آزاد اسلامی

واحد دامغان

دانشکده علوم پایه

 پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد «M.Sc.»

گرایش میکروبیولوژی

 عنوان:

بررسی مقاومت نسبت به نالیدیکسیک اسید و مطالعه مولکولی آن در

سویه های شیگلا جدا شده از موارد بالینی در تهران

استاد راهنما:

دکتررضا رنجبر

 استاد مشاور:

دکتر مجید مقبلی

 
تکه هایی از متن به عنوان نمونه :
فهرست مطالب
عنوان     صفحه
چکیده ۱
فصل اول:کلـیات تحقیق
۱- مقدمه ۲
۱-۱ بیان مسئله ۲
۱-۲ کلیات ۴
۱-۲-۱ باکتریولوژی شیگلا. ۴
۱-۲-۲ طبقه بندی شیگلا. ۴
۱-۲-۳ فاکتورهای ویرولانس شیگلا. ۵
۱-۲-۴ توصیف علائم بیماری ناشی از عفونت با شیگلا. ۶
۱-۲-۵ اپیدمیولوژی. ۷
۱-۲-۶ تشخیص آزمایشگاهی. ۸
۱-۲-۶-۱ کشت ۸
۱-۲-۶-۲ تست های بیوشیمیایی. ۹
۱-۲-۶-۳ روش های مولکولی(PCR ) 10
۱-۲-۷ کنترل و پیشگیری. ۱۰
۱-۲-۷-۱ بهداشت فردی. ۱۰
۱-۲-۷-۲   واکسن ها ۱۰
۱-۲-۸ درمان. ۱۱
۱-۲-۸-۱   مقاومت دارویی و اهمیت آن در شیگلا. ۱۲
۱-۲-۸-۲ تاریخچه استفاده از کینولون ها و فلوروکینولون ها به عنوان آنتی بیوتیک ۱۳
۱-۲-۸-۳ کاربرد فلوروکینولون ها در درمان عفونت های انسانی. ۱۴
۱-۲-۸-۴ مکانیسم عمل کینولون ها ۱۶
۱-۲-۸-۴-۱ آنزیم DNA جیراز ۱۶
۱-۲-۸-۴-۱-۱ نقش آنزیم DNA جیراز سلول های باکتریایی. ۱۷
۱-۲-۸-۵   مقاومت به فلوروکینولون ها ۱۷
۱-۲-۸-۵-۱ موتاسیون در ژن های شیگلا. ۱۸
۱-۲-۸-۵-۲ تغییرات در توپوایزومراز IV 18
۱-۲-۸-۵-۳ مقاومت وابسته به پلاسمید. ۱۹
۱-۲-۸-۵-۴ کاهش جذب و تغییرات در افلوکس پمپ ها ۲۰
۱-۲-۸-۵-۵ تغییرات در غشاء خارجی. ۲۰
۱-۲-۹ عوارض فلوروکینولون ها ۲۰
۱-۳ اهداف تحقیق. ۲۱
۱-۳-۱ هدف کلی تحقیق. ۲۱
۱-۳-۲ اهداف جزئی تحقیق. ۲۱
۱-۳-۳ هدف کاربردی. ۲۱
۱-۳-۴ فرضیات ۲۲
۳-۶ تعاریف واژه ها ۲۲
فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده
۲-۱ مروری بر تحقیقات انجام شده ۲۳
فصل سوم:مواد وروش ها
۳-۱- دستگاه‌ها، تجهیزات و مواد مورد استفاده ۲۶
۳- ۱- ۱- فهرست وسایل به کار گیری شده ۲۶
۳- ۱- ۲- فهرست مواد به کار گیری شده ۲۷
۳- ۱- ۳- ترکیبات و محلول های مورد نیاز و فرمول ساخت ۲۷
۳-۲- روش مطالعه و اجرای طرح. ۲۸
۳- ۲- ۱- نوع مطالعه ۲۸
۳- ۲- ۲- جامعه مورد مطالعه ۲۸
۳- ۲ – ۳- تعداد نمونه های مورد استفاده ۲۸
۳-۲–۴- روش تجزیه و تحلیل داده ها ۲۸
۳- ۲- ۵- ملاحظات اخلاقی. ۲۹
۳- ۲- ۶- مشکلات و محدودیت ها ۲۹
۳- ۲ – ۷- جمع آوری اطلاعات بیماران. ۲۹
۳- ۳- انجام امور باکتریولوژیک ۲۹
۳- ۳ – ۱-کشت، جداسازی و تعیین هویت باکتریها ۲۹
۳- ۳ – ۲-بررسی حساسیت آنتی بیوتیکی. ۳۰
۳- ۳ – ۳- روش تعیین حساسیت باکتری ها نسبت به آنتی بیوتیک ۳۰
۳- ۳ -۳- ۱-تهیه ی محیط کشت ۳۰
۳- ۳ -۳- ۲-تهیه ی سوسپانسیون میکروبی. ۳۰
۳- ۳ -۳- ۳-مرحله دیسک گذاری. ۳۱
۳- ۴- انجام آزمایشات مولکولی. ۳۱
۳- ۴ – ۱- استخراجDNA باکتری. ۳۱
۳- ۴ – ۱- ۱-کشت ۳۱
۳- ۴ – ۱- ۲- جداسازی رسوب باکتری. ۳۱
۳- ۴ – ۱- ۳- نگه داری DNA استخراج شده ۳۲
۳- ۴ – ۱- ۴- اندازه گیری مقدار DNA استخراج شده ۳۳
۳- ۴ – ۲- پرایمر های مورد استفاده جهت شناسایی ژنهای gyrA. 33
۳ -۴-۲–۱- طراحی و سنتز پرایمر و بررسی کیفیت پرایمر ها ۳۳
۳-۴-۳- PCR 34
۳-۴-۳-۱-گرادیانت دمایی جهت بدست آوردن دمای اتصال. ۳۴
۳-۴–۳-۱- بررسی جهش ای احتمالی بر روی ژن gyrA با استفاده ازPCR-RFLP پرایمر (L وD) 38
۳-۴–۴- الکتروفورز ۳۹
۳-۴-۴–۱- الکتروفورز محصول PCR 39
۳-۴-۴–۲- رنگ آمیزی ژل و عکس برداری. ۳۹
۳-۴-۵- ترادف یابی. ۴۰
فصل چهارم:نتایج تحقیق
۴- ۱- نتایج کشت جداسازی و تعیین هویت باکتری ها و اطلاعات مربوط به بیماران. ۴۱
۴-۲- فراوانی بیماران بر اساس سن و سال و جنس. ۴۲
۴-۳- نتایج مربوط به توزیع سرو گروه های شیگلا. ۴۳
۴-۴- نتایج مربوط به حساسیت آنتی بیوتیکی. ۴۴
۴-۵- نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژنgyrA در سویه های مقاوم نسبت به نالیدیکسیک اسید. ۴۶
۴-۶- انجام آزمون روی سایر ایزوله ها توسط Primer L. 48
۴-۷- بررسی جهش های احتمالی بر روی ژن gyrA با بهره گرفتن از PCR-RFLP. 52
۴-۸- انجام آزمون روی سایر ایزوله ها توسط Primer D 57
۴-۹- بررسی جهش های احتمالی بر روی ژن gyrA با بهره گرفتن از PCR-RFLP. 61
۴ – ۱۰- نتایج مربوط به بررسی وجود ژنهای qnrA، qnrB، qnrS در نمونه های بالینی شیگلا. ۶۵
۴ – ۱۱- نتایج تعین توالی. ۶۸
فصل پنجم:بحث و نتیجه گیری
۵-۱ بحث و نتیجه‌گیری. ۷۴
منابع فارسی و لاتین. ۸۲
چکیده
شیگلوزیس بطور شایعی مربوط به کودکان بوده به طوری که در اغلب موارد عفونت را کودکان کمتر از پانزده سال سن تشکیل می دهند. فلوروکینولون­ها بطور موفقیّت آمیزی برای درمان شیگلوزیس، از جمله عفونت­های ناشی از سویه­های با مقاومت چند گانه آنتی بیوتیکی استفاده می­گردند. اما به مرور زمان سویه های مقاوم آنتی بیوتیکی به وجود آمده است، اهمیّت این موضوع به این دلیل است که مصرف بی رویه و غیر منطقی آنتی بیوتیک بدون توجه به الگو های مقاومتی می تواند باعث ظهور سویه هایی شود که حتی به درمان های جدید نیز مقاومت داشته باشند و ظهور سویه های جدید مقاوم به نالیدیکسیک اسید روشن کننده این واقعیّت می باشد. بنابراین بررسی مولکولی این نوع مقاومت ها بسیار حائز اهمیّت خواهد بود. گزارشات در خصوص بروز سویه­های شیگلا مقاوم به فلوروکینولون­ ها محدود است. لذا مطالعه حاضر با هدف بررسی فراوانی موتاسیون­های ژن gyrA ژن­های و وجود qnr در سویه­های شیگلا های جدا شده از بیماران مبتلا به شیگلوز در تهران انجام گردید. در مجموع ۷۳ سویه شیگلا جدا شده از موارد بالینی در این مطالعه مورد بررسی قرار گرفت. سویه­های شیگلا با بهره گرفتن از روش­های استاندارد میکروبیولوژیک جداسازی و تعیین هویت گردیدند. تست حساسیت آنتی بیوتیکی و غربالگری سویه­های شیگلا مقاوم به فلوروکینولون­ها مطابق با دستورالعمل­های استاندارد CLSI انجام پذیرفت. حضور ژن­­های qnr از جمله qnrA، qnrB و qnrS توسط تکنیک PCR با بهره گرفتن از پرایمر­های اختصاصی مورد بررسی قرار گرفت. همچنین تکثیر از لوکوس ژنتیکی ناحیه مقاومت کینولونی ژن gyrA با بهره گرفتن از PCR انجام پذیرفت. سپس موتاسیون­های ژن gyrA توسط تکنیکRFLP و با بهره گرفتن از آنزیم محدود الاثر HinfI تعیین گردید. تمام آمپلیکون­های مربوط به نمونه­های موتانت مشخص شده توسط هضم آنزیمی با ترادف یابی مورد تایید قرار گرفت. نتایج مربوط به حساسیت آنتی بیوتیکی بر روی ۷۳ نمونه بالینی شیگلا نشان داد که ۲/۹۷ درصد از ایزوله ها حداقل به یکی از ۱۸ آنتی بیوتیک مقاومت نشان می دهند و بیشترین میزان مقاومت به آنتی بیوتیک ها به ترتیب تری متوپریم+سولفامتوکسازول (۵/ ۹۴ درصد) و بعد از آن استرپتومایسین (۲/۹۳ درصد) و تتراسایکلین (۲/۹۳ درصد) بود. همچنین هیچ ایزوله ای به آنتی بیوتیک سیپروفلوکسازین و سفتی زوکسیم مقاومت نشان نداد. ۲۳ (۶/۳۱ درصد) ایزوله مقاومت به نالیدیکسیک اسید را نشان دادند. همچنین تمامی نمونه های موتانت پس از PCR با بهره گرفتن از پرایمر DgyrA و سپس بدنبال انجام هضم آنزیمی الگوی باندی ۲۳۴و۲۷۷ جفت بازی را نشان داده و همین نمونه ها در مورد پرایمر LgyrA الگوی باندی۳۱۵ و۳۳۳ را به نمایش گذاشتند. نمونه های نرمال حاصل از تکثیر پرایمر DgyrA نیز پس از انجام RFLP قطعات۹۹و۱۷۸و۲۳۴جفت بازی را نشان داده و همین نمونه ها در مورد پرایمر LgyrA قطعات۹۹و۲۳۴و۳۱۵ جفت باز را نمایش دادند. تمامی نتایج با Sequencing تایید گردید. در خوانش کامل اولیه از موتانت های واجد موتاسیون در ژن gyrA، تغیر نقطه ای در کدون۸۳ نشان داده شد که حاصل جایگزینی یک نوکلئوتید به نوکلئوتید دیگر بوده است. نتیجه این تغیر، جایگزینی اسید آمینه سرین به لوسین بود. در خوانش کامل دومین موتانت های واجد موتاسیون در ژن gyrA، تغیر نقطه ای در کدون۸۳ نشان داده شد که حاصل جایگزینی یک نوکلئوتید به نوکلئوتید دیگر بوده است. از میان دو نمونه موتانت شیگلا ۱ نمونه (۵۰درصد) به سروتایپ شیگلا فلکسنری و ۱ نمونه (۵۰درصد) به سروتایپ شیگلا سونئی تعلق داشت. از میان ۲۳ سویه مقاوم شیگلا مقاوم به نالیدیکسیک اسید، ۴ نمونه واجد ژن qnrS بودند.
مطالعه حاضر، برای اولین بار به صورت جامع، مکانیسم مولکولی مقاومت به نالیدیکسیک اسید در سویه­های شیگلا در تهران را مشخص نمود.
واژه­های کلیدی: موتاسیون­های gyrA، نالیدیکسیک اسید، ژن qnr، شیگلا
۱- مقدمه
۱-۱ بیان مسئله
شیگلا یکی از اعضای خانواده بزرگ باکتریهای روده ای یعنی انتروباکتریاسه می باشد. بیش از چهل سروتایپ مختلف از این باکتری در چهار گونه یا سروگروه اصلی شامل: سروگروهA ( شیگلا دیسانتریه)، سروگروه B (شیگلا فلکسنری)، سروگروه C (شیگلا بوئیدی) و سروگروه D (شیگلا سونئی) شناسایی شده اند. بیماری شیگلوز (دیسانتری یا اسهال خونی باسیلی) یک گاستروانتریت ناشی از آلودگی با گونه های باکتریایی جنس شیگلا می باشد ; ۲۰۰۳) Ranjbar et al). شیگلوز همراه با درد های شدید شکمی، درد، تب، مدفوع خونی و موکوسی شناخته می شود. در میان ۵۰ سروتایپ شیگلا دیسانتری تیپ ۱ به شدت بیماری زا می باشد(et al; 2005 Niyogi).
دیسانتری باسیلی بطور شایعی مربوط به کودکان بوده به طوری که هفتاد درصد از موارد عفونت را کودکان کمتر از پانزده سال سن تشکیل می دهند. شیگلوز از طریق دهانی – مدفوعی انتقال می یابد. این بیماری در ابتدا از طریق دستان آلوده افراد و به میزان کمتر از طریق آب یا غذای آلوده منتقل می شودRanjbar et al; 2008)).
سالانه ۵ میلیون مورد مرگ و میر ناشی از گاستروانتریت در کشورهای در حال توسعه رخ می دهد که دست کم ده درصد این موارد به دلیل دیسانتری ناشی از شیگلا است (Koorosh et al; 2003). اغلب موارد شیگلوز در سنین پس از شیر خوارگی به خصوص در سن نوپایی دیده می شودMache et al; 1997)). اثر منفی عفونت شیگلایی بر رشد و نمو و سوء تغذیه کودکان در مطالعات مختلف نشان داده شده است. شیوع عفونت شیگلایی در میان عوامل ایجادکننده گاستروانتریت های حاد بر اساس مطالعات انجام شده در تهران ۱ تا ۲ در صد می باشد. به نظر می رسد، تنوع فراوانی الگو های ژنتیکی موجود در یک گونه شیگلا مانند: شیگلا سونئی در یک کشور باعث بروز الگوها ی متنوع مقاومت به آنتی بیوتیک شده است. الگوی متنوع مقاومت به آنتی بیوتیک در نقاط مختلف جغرافیایی همواره انتخاب یک داروی مناسب برای شیگلا را مشکل کرده است و به همین علّت، انجام مطالعات مقاومت دارویی ضروری است. با توجه به افزایش مقاومت به آنتی بیوتیک های مختلف در سال های اخیر در نقاط مختلف دنیا، انتخاب بیماران که کاندیدهای درمان آنتی بیوتیکی هستند از اهمیّت بالایی برخورداراست (Peirano et al; 2006).
پاتولوژی پیچیده سندرم اسهال خونی بازتابی از وجود ترکیبات متنوع ژنتیکی کنترل کننده بیماری زایی این ارگانیسم است. مهمترین عامل بیماری زا در این باکتری اگزو توکسین آن می باشد، که به دو زیر واحد A وB با سمیّت بسیار بالا تقسیم می شود که یک مولکول هگزامری با وزن مولکولی حدود ۷۰ کیلو دالتون است که با اتصال به رسپتور های سطحی سلول هدف باعث اپوپتوزیس و مرگ سلول خواهد شد. این توکسین را شیگلا دیسانتری نوع ۱ تولید می کند و توکسینی مشابه آن را اشرشیا کولی تولید می کند به نام های ۱stx و۲stx   که تا ۹۸ درصد تشابه دارند. حساسیت سلول های اندوتلیال کلیه انسان به stx در مقایسه با ۱stx تا ۱۰۰۰ برابر بیشتر است به همین دلیل عامل اصلی بیماری خون ادراری HUS معرفی گردیده است. سمیّت و قدرت ایمنی زایی شیگا توکسین stx بسیار بالا می باشد به شکلی که حدود ۲۸ نانو گرم از آن باعث مرگ یک موش می شود و همچنین به دلیل داشتن قدرت آنتی ژنی بالا دارای پتانسیل ایجاد پاسخ ایمنی و تولید آنتی بادی علیه توکسین در بدن بیمار می شود. زیر واحد stxBبا ۶۹ اسید آمینه و زیر واحد stxAبا حدود ۲۹۴ اسید آمینه با وزن مولکولی در حدود ۳۲ کیلو دالتون متصل است. رسپتور زیر واحد B به رسپتور سطحیGb3 متصل شده و تشکیل یک کمپلکس را می دهد (Goguen et al; 2003).
افزایش مقاومت نسبت به اکثر آنتی بیوتیک های رایج به یک نگرانی بزرگ در کشورهای توسعه یافته و در حال توسعه تبدیل شده است. کینولون ها ازجمله نالیدیکسیک اسید به عنوان داروی خط اول در درمان عفونت های ناشی از شیگلا مورد استفاده قرار می گیرد، اما متأسفانه در برخی از مطالعات مقاومت به این آنتی بیوتیک گزارش شده است. برای مثال در ایران نتایج مطالعات نشان داده است در سال های ۲۰۰۱ تا ۲۰۰۳ ، میزان مقاومت به این آنتی بیوتیک ۱۳ درصد بوده و این میزان در سال های ۲۰۰۴ تا ۲۰۰۶ به ۲۵ درصد افزایش یافته است. نالیدیکسیک اسید به دلیل مقرون به صرفه بودن از مناسب ترین آنتی بیوتیک ها به شمار می آید. کینولون ها و فلوروکینولون ها ترکیباتی هستند که هدف آنها DNA جیراز و توپوایزومراز IV می باشد و با ایجاد کمپلکس دارو سبب جلوگیری از سنتز اسید نوکلئیک می شوند. با توجه به افزایش مقاومت و انجام نگرفتن مطالعات جامع مولکولی بر روی سویه های مقاوم نسبت به نالیدیکسیک اسید، بر آن شدیم به مطالعه شیوع موتاسیون ها بر روی ژنgyrA و بررسی وجود ژنهای qnr در سویه های سویه های مقاوم نسبت به نالیدیکسیک اسید شیگلا جدا شده در تهران بپردازیم.
۱-۲ کلیات
۱-۲-۱ باکتریولوژی شیگلا
شیگلا متعلق به خانواده انتروباکتریاسه می باشد. این باکتری غیر متحرک و بدون کپسول می باشد. ۴ گونه شیگلا وجود دارد که بر اساس خصوصیات بیوشیمیایی مختلف طبقه بندی می شوند. زیر