تنوع ژنتیکی به تنوع ژنی درون گونه­ ها اطلاق می­ شود. به عبارتی تنوع ژنتیکی، تنوع قابل توارث درون و بین جمعیت­هاست. کلیه تنوع­های موجود با توالی چهار جفت باز تشکیل­دهنده مولکول DNA، اجزا سازنده کدهای ژنتیکی مرتبط می­باشند. انواع دیگری از تنوع ژنتیکی را نیز می­توان در کلیه سطوح سازماندهی شده در هسته شامل مقدار DNA، تعداد کروموزم و ساختار DNA شناسایی کرد. تنوع و تکامل ژنتیکی در جمعیت­های گیاهی می ­تواند بوسیله جهش، نوترکیبی، مهاجرت، رانده شدن ژنتیکی و گزینش ژنتیکی ایجاد شده باشد (۶۴). کسب اطلاع از فاصله ژنتیکی در بین افراد یا جمعیت­ها و آگاهی از روابط خویشاوندی گونه­ های مورد­نظر در برنامه ­های اصلاحی، امکان سازمان­دهی ژرم­پلاسم و نمونه گیری مؤثر از ژنوتیپ­ها را فراهم می­سازد (۱). قدم اول در اصلاح خصوصیات گیاهی، فهم از ساختار کلکسیون ژرم­پلاسم است که این موضوع به نوبه خود نمونه گیری سیستماتیک ژرم­پلاسم را برای مقاصد اصلاحی و حفاظتی امکان­ پذیر می­سازد. برای بهره ­برداری از منابع ژنتیکی با حداکثر کارآیی، شناخت مواد ژنتیکی نگهداری شده ضرورت دارد. ارزیابی نمونه­ها می ­تواند با توجه به هدف استفاده از ژرم­پلاسم صورت گیرد که جنبه­ های اگرونومیکی، پاتولوژیکی، مورفولوژیکی، سیتولوژیکی، بیوشیمیایی و مولکولی از جمله این اهداف است. در راستای این ارزیابی نقاط قوت و ضعف توده­ها و ژنوتیپ­ها و پتانسیل­های موجود در آنها شناخته می­ شود. به عبارت دیگر در این ارزیابی­ها وسعت پایه ژنتیکی هر صفت معلوم می­گردد (۱۲ ،۷ و۶) تنوع ژنتیکی یک صفت معین، اندازه پراکنش ارزش­های همان صفت است، به طوری که تأثیر محیط بر آن زدوده شده باشد. تنوع بین گیاهان یک گونه گیاهی خاص بر دو نوع است: تنوع بر اثر محیط، که به مقادیر مختلف تنش محیطی واکنش می­دهد و با مقایسۀ گیاهان دو جمعیتی که از لحاظ ژنتیکی یکنواخت هستند، می­توان آنرا مشاهده نمود. تأثیر محیط روی یک گیاه، به نتاج آن منتقل نمی­ شود و بنابراین انتخاب در یک جامعه یکنواخت ژنتیکی، به جدا نمودن نژادهایی که در واکنش به تنش­های محیطی اختلاف دارند، نمی­انجامد. تنوع ارثی به تنوع موجود در یک جمعیت مخلوط ژنتیکی، که از عوامل ارثی ناشی شده و به نتاج انتقال می­یابد، اطلاق می­گردد .از آنجایی که این نوع تنوع، ناشی از عوامل ارثی است و به نتاج قابلیت انتقال دارد، لذا در اصلاح نباتات و برنامه ­های اصلاحی حائز اهمیت است، منشأ تنوع ارثی در گیاهان، نوترکیبی­های ژنتیکی، تغییرات درکروموزوم­ها و جهش­ها است (۷).

۱-۱۱-۱ اهمیت تنوع ژنتیکی و روش­های مختلف ارزیابی آن

شناخت کیفی و کمی تنوع ژنتیکی از اهمیت زیادی در علوم بیولوژی مانند اکولوژی، بیولوژی تکامل، تاکسونومی یا رده­بندی، ژنتیک و اصلاح نباتات برخوردار است. اهمیت تنوع ژنتیکی به خوبی برای همه روشن بوده و نشان داده شده است که کاهش تنوع ژنتیکی می ­تواند منجر به کاهش شایستگی و سازگاری به تغییرات محیطی گردد. ارزیابی تنوع ژنتیکی معمولاً در سطح مولکولی و با بهره گرفتن از چندین روش آزمایشگاهی انجام می‌گیرد که از آن میان می‌توان به آللوزایم­ها^[۷] ، آنالیز DNA^[8] و ایزوزیم­^[۹]ها اشاره کرد که قادرند ارزیابی دقیقی از تنوع ژنتیکی را فراهم نمایند. ارزیابی ترکیب ژنتیکی گیاهان زراعی و مجموعه­های ژنتیکی و قرابت بین آن­ها از گذشته­ های دور معمول بوده است، بطور تاریخی این تخمین براساس بیولوژی اندام­های جنسی، داده ­های اکو­جغرافیایی، زیست­شناسی، رنگیزه­ها و شجره­نامه و اخیراً با بهره گرفتن از نشانگر­های پروتئینی مانند ایزوزایم­ صورت می­گرفته است همچنین تنوع ژنتیکی ممکن است با بهره گرفتن از صفات مورفولوژیکی نیز مورد ارزیابی قرار گیرد. بررسی صفات مورفولوژیکی به تکنولوژی گرانی نیاز ندارد ولی اغلب، این فعالیت­ها به زمین وسیعی نیاز دارند که این امر می‌تواند سبب شود که این روش نسبت به روش‌­های مولکولی هزینه بیشتری داشته باشد. بعلاوه این صفات اغلب تحت تأثیر نوسانات محیطی قرار می‌گیرند که موجب می‌شود ارزیابی تنوع تحت تأثیر محیط باشد. با بررسی مجموعه­های ژنتیکی با بهره گرفتن از نشانگر­های مولکولی مبتنی بر DNA، تفاوت­های ژنتیکی بیشتری مشاهده شده، این تفاوت­ها تحت تأثیر محیط و اثراتی مانند پلیوتروپی، اپی­ستازی و دوره رشدی گیاه نخواهند بود و امکان آگاهی دقیق و کافی از تنوع ژنتیکی در سطح DNA را فراهم می­سازند. با توجه به اهمیت روزافزون تولید واریته­های برتر و نیاز به شناسایی و استفاده از آلل­ها و ژن­هایی که صفات مطلوبی را کنترل می­نمایند، استفاده از نشانگر­های DNA روز­افزون خواهد بود.

۱-۱۲ انواع نشانگر­ها:

مارکر­ها انواع مختلفی دارند. در یک تقسیم ­بندی کلی می­توان مارکر­ها را به صورت زیر دسته­بندی کرد:
۱- مارکر­های مورفولوژیکی یا فنوتیپی
۲- مارکر­های مولکولی
مارکر­های مولکولی خود به دو دسته تقسیم می­شوند:
۱- مارکر­های بیو­شیمیایی
۲- مارکر­های DNA

۱-۱۲-۱ نشانگر­های مورفولوژیکی

مارکر­های مورفولوژیکی همانگونه که از نام آنها مشخص است از روی فنوتیپ ارزیابی می­شوند و لذا ارزیابی آنها خیلی ساده است. تعداد این مارکر­ها کم است و پلی­مورفیزم کمی نیز تولید می­ کنند. از طرفی در اغلب موارد مارکر فنوتیپی در واقع یک صفت نامطلوب است، مثلا کوتولگی بوته، ابلق بودن برگ ها و … . لذا امروزه از این نوع مارکر­ها استفاده نمی­ شود. نشانگرهای مورفولوژیکی اولین نشانگر­هایی بودند که برای ارزیابی تنوع ژنتیکی مورد استفاده قرار گرفتند (۲۰). نشانگر­های مورفولوژیک که پیامد جهش­های قابل رویت در مورفولوژی هستند، شامل دامنه وسیعی از ژن­‌های کنترل­ کننده صفات مورفولوژیک می­شوند که بر ظاهر یا فنوتیپ موجود مبتنی بوده و جزو نخستین نشانگرها به شمار می­آیند که از زمان­های بسیار دور، یعنی زمانی که هنوز محل ژن روی کروموزوم مشخص نشده بود، مورد استفاده قرار می­گرفتند. دلایل عمده محدودیت استفاده از نشانگرهای مورفولوژیکی عبارتند از: تعداد این نشانگر­ها کم بوده، وابسته به سن و مرحله رشدی گیاه هستند و غالباً از شرایط محیطی تأثیر می­پذیرند و درضمن اساس ژنتیکی بسیاری از آنها هنوز مشخص نشده است. در صورتی که هنوز بررسی تنوع ژنتیکی بر اساس صفات مورفولوژیک یک گام اولیه در جهت توصیف و گروه­بندی ژرم­پلاسم­ها است (۵۷).

۱-۱۲-۲ نشانگر­های بیوشیمیایی

نشانگرهای بیوشیمیایی شامل موارد متعددی است. این نوع مارکر­ها نیز امروزه کارایی زیادی ندارند چرا که تعداد آنها کم بوده و پلی­مورفیزم کافی ایجاد نمی­کنند، لیکن نکته مثبت در آنها هم­بارز بودن است.
این گروه را می­توان به دسته­های زیر تقسیم کرد:
الف. مولکول­های بیوشیمیایی کوچک: مثل ترکیبات فنلی، ترکیبات معطر و …
ب. پروتئین­های ذخیره­ای: مثل گلوتنین و گلیادین که در گندم خصوصا در تعیین ارزش نانوایی کاربرد دارد.
ج. آیزوزایم­ها: اینها در واقع فرم­های مختلف یک آنزیم هستند که یک واکنش را کاتالیز می­ کنند ولی ممکن است سرعت فعالیت آنها متفاوت باشد. این مارکر­ها در دهه ۸۰ کاربرد زیادی داشتند. تنکسلی توانست بر اساس آیزوزایم­ها در گوجه فرنگی اولین نقشه لینکاژی را طراحی نماید. و معایب آیزوزایم‌­ها عبارتند از: تنها تعداد محدودی آیزوزایم برای هر گونه وجود دارد، تعداد سیستم‌های آنزیمی چند شکل و قابل دسترس محدود است و مکان‌های آنزیمی فقط شامل قسمت محدود و غیر­تصادفی از ژنوم هستند (قسمت بیان­شونده). بنابراین تنوع مشاهده شده ممکن است بیانگر کل ژنوم نباشد. اگرچه با این روش می‌توان تعداد زیادی از نمونه‌ها را بررسی کرد ولی مقایسه نمونه‌ها از گونه‌های مختلف، مکان‌های ژنی و آزمایشگاه‌های مختلف مشکل ساز است. بطوریکه این روش تحت تأثیر روش­‌های استخراج، بافت گیاه و مرحله رشد گیاه قرار می‌گیرد(۶۲و۴۲).
د. آللوزایم‌­ها آلل­‌های متفاوت آنزیم‌­ها هستند که یک ارزیابی از فراوانی ژنی و ژنوتیپی در درون و بین جمعیت‌­ها ارائه می‌دهند که این اطلاعات می­‌توانند جهت گروه‌بندی جمعیت‌­ها، تنوع ژنتیکی، جریان ژن، ساختار ژنتیکی گونه­ ها، مقایسه میزان تلاقی­‌های بین‌­گونه‌ای، ساختار جمعیت و واگرایی جمعیت­‌ها استفاده شوند (۴۲).
مزیت­های مهم این‌گونه نشانگر­ها عبارتند از: ارزیابی به صورت هم­‌بارز و بدون دخالت تأثیرات اپیستازی و پلیوتروپی، کاربرد آسان و هزینه پائین.

۱-۱۲-۳ نشانگر­های مولکولی مبتنی بر DNA

مارکر­های DNA در واقع مهم­ترین و کاربردی­ترین سیستم­های مارکری هستند که گستردگی زیادی داشته و هر­روزه در حال توسعه و تکامل هستند. از آنجا که در اولین سطح بیان ژن مطرح می­شوند، خیلی دقیق بوده، دارای تنوع زیاد و پلی­مورفیزم بالا هستند.
نشانگر­های مولکولی بر اساس آشکارسازی تفاوت‌ (چندشکلی^[۱۰]) موجود در بین اسید­های نوکلئیک افراد مختلف عمل می‌کنند. این تفاوت‌­ها شامل پدیده­‌های حذف، اضافه، جابجایی، دو برابر شدن و جهش‌­های نقطه‌ای است و تنها ژن‌های خاص و فعال را شامل نمی‌شود. نشانگر­های مولکولی علاوه بر اینکه تحت تأثیر محیط نیستند دارای مزیت­‌های زیر می­باشند:
۱- تمام قسمت‌های ژنوم را پوشش می‌دهند (اگزون‌­ها، اینترون­‌ها و نواحی تنظیم­کننده).
۲- تحت تأثیر پلیوتروپی و اپیستازی قرار نمی‌گیرند.
۳- قادر به شناسایی تفاوت­‌هایی هستند که تنوع فنوتیپی نشان نمی‌دهند.
۴- بعضی از آنها هم­‌بارز هستند.
روش­‌های مختلف مورد استفاده شامل: هضم و هیبریداسیون اسید­های نوکلئیک، روش­های مبتنی بر واکنش­‌های زنجیره­‌ای پلیمراز (^[۱۱]PCR) و یا ترکیبی از دو روش ذکر­شده هستند. بعلاوه روش‌­های مختلف نشانگری می‌توانند یک مکان یا چند مکان ژنومی را مورد بررسی قرار ‌دهند. بطوریکه نشانگر­های چند مکانی^[۱۲] قادرند بطور همزمان چندین مکان ژنومی را مورد بررسی قرار دهند. این نشانگر­ها مبتنی بر تکثیر تصادفی DNA بواسطه آغازگر­های الیگونوکلئوتیدی با توالی‌­های انتخابی هستند، این گونه نشانگر­ها را نشانگر‌­های غالب نیز می‌نامند. بنابراین امکان تشخیص حضور یا عدم حضور باند برای هر مکان وجود دارد ولی امکان تشخیص حالت­‌های هتروزیگوت (A/-) یا هموزیگوت (a/a) برای آلل‌­های مشابه وجود ندارد. در حالیکه نشانگر­های یک مکانی^[۱۳] از کاوشگر­ها یا آغازگر­های ویژه برای مکان‌­های ژنی استفاده می‌­کنند و قادر به تکثیر یا دورگ­گیری DNA با توالی‌­های شناخته­شده هستند. این نشانگر­ها را نشانگر­های هم­‌بارز نیز می­‌نامند که امکان تشخیص مکان‌­های هموزیگوت و هتروزیگوت را به ما می­‌دهند(۴۲).
روش‌های نشانگری پایه را می‌­توان به ۲ دسته تقسیم کرد:
۱-روش­‌های غیر مبتنی بر PCR یا روش­‌های مبتنی بر هیبریداسیون.
۲-روش­‌های مبتنی بر PCR

۱-۱۲-۳-۱ روش‌های غیر مبتنی بر PCR

روش­های مولکولی مبتنی بر هیبریداسیون از اولین نشانگر­هایی هستند که در مطالعات گیاهی مورد­استفاده قرار گرفتند. این نشانگر­ها شامل استفاده از آنزیم‌­های برشی و روش­‌های دورگ­گیری بودند (۵۹). آندونوکلئار­های هضم­کننده، آنزیم‌­های باکتریایی هستند که قادر به شناسایی توالی‌ پالیندرم ویژه و برش DNA هستند که این برش سبب ایجاد قطعاتی با اندازه‌­های مختلف می‌شود. تغییرات درون توالی (مثل جهش نقطه‌ای)، جهش­های بین مکانی (مثل حذف و جابجایی) و جهش­های درون مکان آنزیمی می­‌توانند منجر به تفاوت طول قطعات بعد از برش آنزیمی شوند. نشانگر­های RFLP^[14] و تعداد متفاوت ردیف‌­های تکراری (^[۱۵]VNTR)، نمونه­‌هایی از نشانگر­های مبتنی بر هضم و هیبریداسیون هستند. در RFLP چند­شکلی DNA بوسیله هیبریداسیون کاوشگر (که به روش شیمیایی نشاندار شده است) با قطعاتDNA انتقال سادرن­یافته انجام می‌گیرد که سبب ایجاد پروفایل­هایی از قطعات DNA می­ شود. نشانگر RFLP دارای چند­شکلی نسبتاً زیادی است، توارث هم­بارز داشته و تکرار­پذیری بالایی نشان می­‌دهد. در این روش لکه‌های DNA حاصل از دورگ گیری را می‌توان پاک کرد و قطعات انتقال سادرن­یافته را دوباره با کاوشگر­های ^[۱۶]‌ RFLP جدید (۸ تا ۱۰ مرتبه) مورد بررسی قرار داد. با این وجود، این روش‌­ها به علت وقت­‌گیر بودن، داشتن مواد رادیواکتیویته­ی گران­قیمت و سمی و نیاز به DNA با کیفیت و کمیت بالا به طور وسیع مورد­استفاده واقع نمی‌شوند. بعلاوه این نشانگر­ها به اطلاعات اولیه از توالی DNA‌ جهت ساختن کاوشگر نیاز دارند که سبب پیچیدگی روش می‌­شود. این محدودیت­‌ها سبب شده است که روش­‌های با پیچیدگی کمتر مانند نشانگر­های مبتنی بر PCR توسعه یابند (۴۲). بازر­ترین نوع این مارکرها، RFLP می­باشد. VNTR­ها و میکروستلایت­ها نیز در این گروه قرار دارند. در این نوع مارکر­ها یک قطعه DNA نشاندار شده (پروب) جهت هیبریداسیون استفاده می­ شود. RFLP در سال ۱۹۸۰ توسط Botstain ابداع شد و دقت بسیار زیادی دارد، لیکن امروزه صرفا به دلیل وقت­گیر و پر­زحمت بودن آن، کمتر استفاده می­ شود.

۱-۱۲-۳-۲ نشانگرهای مبتنی بر PCR

این نشانگر­ها که کاربرد آنها سیر صعودی دارد، توسط مولیس و همکارانش (۱۹۸۶) توسعه پیدا کرده و از واکنش‌­های زنجیره‌ای پلی‌مراز (PCR) پیروی می‌کنند. این تکنیک شامل تکثیر چندین قطعه DNA مجزا است که توالی­‌های اطراف آنها بسیار مشابه آغاز­گر می­‌باشد، این نواحی باید به قدر کافی به همدیگر نزدیک باشند تا تکثیر انجام گیرد. استفاده از آغازگر­های تصادفی محدودیت داشتن اطلاعات اولیه برای انجام PCR را ندارد. روش­‌های مبتنی بر PCR را می­‌توان به دو گروه: ۱- روش­‌های مبتنی بر PCR توالی­های غیر ویژه. ۲- روش­های مبتنی برPCR توالی­‌های هدف^[۱۷] تقسیم کرد. در این قسمت تعدادی از نشانگر­های مبتنی بر PCR توضیح داده می­ شود (۴۲).

۱-۱۲-۳-۲-۱ نشانگرRAPD^[18]:

نشانگر RAPD، نخستین نشانگر مولکولی مبتنی بر واکنش زنجیره پلی­مراز بود که برای بررسی تنوع ژنتیکی مورد­استفاده قرار گرفت. مارکر­های RAPD از طریق تکثیر تصادفی DNA ژنومی و با بهره گرفتن از آغازگر­های کوتاه ایجاد می­شوند. تفکیک قطعات حاصل بر روی ژل آگارز در حضور اتیدیوم بروماید صورت می­گیرد، و در نهایت، زیر نور ماوراء بنفش مشاهده می­گردد. اگرچه آغازگر­ها دارای توالی­های تصادفی هستند، قادر به یافتن توالی­های هومولوگ مناسب روی رشته DNA می­باشند. چندشکلی­های DNA بدلیل نوآرایی یا حذف در محل اتصال آغازگر­ها یا ناحیه قابل تکثیر ایجاد می­شوند (۶۸).

۱-۱۲-۳-۲-۲ نشانگر^[۱۹]AFLP:

برای غلبه بر محدودیت تکرار­پذیری RAPD، تکنولوژی AFLP توسط شرکت هلندی کی­جن^[۲۰] توسعه پیدا کرد (۶۸). نشانگر AFLP توسط هضم DNA با دو یا چند آنزیم برشی، اتصال آداپتور به دو انتهای قطعات، PCR با آغازگر­های اختصاصی و جداسازی قطعه­های حاصل روی ژل پلی اکریل امید صورت می­گیرد (۱۲). با توجه به نتایج بدست­آمده از آن تکنیک مقرون به صرفه و دارای تکرار­پذیری، ثبات و قابلیت اطمینان بیشتری نسبت به مارکر RAPD می­باشد به همین دلیل بطور وسیعی در تهیه نقشه کروموزومی گیاهان مورد­استفاده قرار گرفته است. در استفاده از این مارکر باید مراحل انجام کار با دقت و کیفیت بالا صورت گیرد (۶۵).

۱-۱۲-۳-۲-۳ نشانگر^[۲۱]SSR:

مورگانت و اولیویری در سال ۱۹۹۳ برای اولین بار ریزماهواره­ها را در توالی گیاهان گزارش کردند. ریز ماهواره­ها یا ردیف های تکراری ساده (SSR) شامل واحد­های نوکلئوتیدی تکی تا شش تایی تکرار شونده هستند که در ژنوم بیشتر یوکاریوت­ها پراکنده­اند (۲۶). معمولاً تکرار­های ۱ تا ۴ نوکلئوتیدی در ژنوم یوکاریوت­ها بیشتر یافت می­شوند. ریزماهواره­ها به صورت طبیعی در نواحی غیر کد­کننده DNA از قبیل اینترون­ها و تـوالی­های بین ژنی دیده می­شوند. ریـز مـاهواره­ها معمولاً نـزدیک بـه SINEs^[22] و LINEs^[23] ها و نزدیک به عناصر شبه رتروترانسپوزون­ها دیده می­شوند (۲۵). ریزماهواره­ها به نواحی کد­کننده ژنوم نیز متصل
شده ­اند (۱۸). ریزماهواره­ها در نقشه­یابی ژنومی، انگشت­نگاری DNA، سازماندهی ژرم­پلاسم و مطالعات سیتوژنتیکی و ارزیابی تنوع ژنتیکی درون جمعیت­ها استفاده می­شوند (۱۲). ریز­ماهواره­ها به دلیل هم­بارز بودن و تبعیت از توراث مندلی و تشخیص آسان افراد هموزیگوس از هتروزیگوسی در بررسی تنوع ژنتیکی و انتخاب والدین برتر استفاده می­شوند (۵۶). نشانگر SSR به دلیل هم­بارز بودن و سطح بالای چند­شکلی و کاربرد آسان این تکنیک، یک روش مناسب برای بررسی تنوع ژنتیکی به حساب می ­آید(۱۸).

۱-۱۲-۳-۲-۴ نشانگرISSR^[24]:

زیتکیویز و همکاران در سال ۱۹۹۴ نشانگر مولکولی جدیدی (مبتنی بر PCR) به نام ISSR را معرفی کردند(۷۶). این تکنیک شامل تکثیر قطعات DNA موجود در فواصل قابل تکثیر بین دو توالی تکراری ریز­ماهواره است که در دو جهت مختلف آرایش یافته­اند. در این نشانگر­ها معمولاً از ریز ماهواره­هایی با طول ۲۵-۱۶ جفت باز به عنوان آغازگر­هایی که در یک واکنش PCR مکان­های ژنومی زیادی را مورد هدف قرار می­ دهند استفاده می­ کنند و به دلیل طویل بودن آغازگرها، تکرار­پذیری بالایی دارند، همچنین طول قطعات تکثیری با هم متفاوت می­باشند. تکرار­های ریزماهواره که به عنوان آغازگر استفاده می­شوند، اصولاً دو، سه، چهار یا پنج نوکلئوتیدی می­باشند. این آغازگر­ها می توانند بدون باز اضافه (۵۵،۳۳و۲۵) یا دارای ۱ تا ۴ باز اضافی به صورت لنگر در انتهای ´۳ یا ´۵ باشند (۷۶). نشانگرISSR تصادفی بوده و تکرار­پذیری و چند­شکلی بالایی دارد و در طیف وسیع از گیاهان استفاده می­ شود. میزان تکرار­پذیری در نشانگر ISSR بین ۹۵-۹۲ درصد است. بخصوص زمانی که از ژل پلی­اکریل­آمید استفاده گردد. این تکنیک نیازمند اطلاعات اولیه در مورد توالی ژنوم نیست و الگوی چند­شکلی زیاد و چند لوکوسی ایجاد می­نماید. میزان DNA مورد استفاده در این تکنیک بسته به نوع گیاه متفاوت و در حدود ۱۰ تا۵۰ نانوگرم می­باشد (۴۳). نشانگر­های ISSR، اغلب به عنوان نشانگر­های غالب معرفی می­شوند که از قوانین توارث مندلی تبعیت می­ کنند (۶۶،۵۶ و ۲۵).

۱-۱۲-۳-۲-۵ نشانگرSRAP^[25]:

لی و کویروس در سال ۲۰۰۱ برای اولین بار نشانگر مولکولی جدیدی به نام SRAP را معرفی کردند(۳۴). SRAP، تکنیک نشانگر تقریبا جدیدی است که توالی کد­دهنده ژنوم را توسط پرایمر­های ۱۷ تا ۱۹ نوکلئوتیدی هدف­گیری می کند (۴۰) که به خصوص برای تکثیر توالی (Open Reading Frame) ORF مورد استفاده قرار می­گیرد و بر مبنای ۲ پرایمر تکثیر­کننده می­باشد (۵۵) . این سیستم نشانگر حتی قابلیت تشخیص میزان بالائی از پلی­مورفیسم را نیز در بین گونه­ ها دارد (۴۷).
مارکر­های SRAP تمام ویژگی­های یک مارکر مولکولی مناسب را از قبیل هم­بارز بودن دارد یعنی می تواند هوموزیگوت­ها را از هتروز­یگوت ها تشخیص دهد (۳۵). پرایمر forword دارای ۱۷ جفت نوکلوئید است که ۱۴ نوکلوئید آن ثابت و غنی ازG,C است و۳ نوکلئوتید متغیر آن در انتهای ^/۳ قرار دارد. این پرایمر ترجیحا ناحیه اگزون را تقویت می­ کند (ناحیه اگزون غنی از G,C است). پرایمر Reverse دارای ۱۹ جفت نوکلئوتید است که ۱۶ نوکلئوتید آن ثابت و غنی ازA,T است و۳ نوکلئوتید متغیر آن در انتهای ^/۳ قرار دارد. این پرایمر ترجیحا ناحیه اینترون­ها وپروموتورها را تقویت می­ کند (۳۵). پلی مورفیسم اساساً از تنوع طول این اینترون­ها وپروموتور­ها و فاصله­ها، ایجاد می­ شود. ۳ نوکلئوتید متغیر انتهایی SRAP می ­تواند بر طبق طراحی ترکیبات مختلف پرایمری تغییر کنند. جفت پرایمر­ها می­توانند با ترکیب پرایمر forword و reverse ترکیبات جدیدی را ایجاد کنند که هزینه سنتز پرایمر­ها را کاهش می­دهد و استفاده از پرایمر­های موثر را افزایش می­دهد (شکل۱-۴).
Ferriol و همکاران گزارش دادند نشانگر SRAPبیشترین هماهنگی را با تغییرات مورفولوژی نسبت به سایر نشانگر­ها دارد. زیرا SRAPباعث تکثیر توالی ORFs(قالب خواندنی باز) می­ شود که در واقع این توالی هدف در ارتباط مستقیم با بروز صفات مورفولوژیکی در موجودات می­باشند. Budakو همکاران (۲۰۰۴). چهار نشانگر درbuffalograss براساس قدرت تنوع ژنتیکی مقایسه کردند(۷۱،۳۶،۴۳و۳۵).
SRAP> SSR> ISSR> RAPD

شکل ۱-۴ نحوه اتصال پرایمرهای forwad و reverse به DNA الگو